中华鳖IGF2和IGF2R基因克隆及其功能研究

【目的】探索胰岛素样生长因子2基因(IGF2)和胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)在中华鳖生长过程中发挥的作用,为揭示IGFs系统在中华鳖异速生长及两性生长差异中的作用机制打下基础。【方法】采用RACE克隆中华鳖IGF2和IGF2R基因c DNA序列,利用BioEdit、ExPASy、TMHMM Server v2.0、SignalP及SMART等在线软件进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR分析IGF2和IGF2R基因在雌雄中华鳖不同组织、不同表型及不同性类固醇激素处理下的表达变化。【结果】中华鳖IGF2基因cDNA序列全长1180 bp,共编码222个氨基酸残基;IGF2蛋白相对分子量为24.84 kD,理论等电点(pI)为9.00,属于跨膜蛋白,含有1个IIGF结构域。中华鳖IGF2R基因cDNA序列全长8765bp,共编码2443个氨基酸残基;IGF2R蛋白相对分子量为271.92kD,pI为5.64,属于跨膜蛋白,含有14个重复的CIMR结构域和1个FN2结构域。基于IGF2和IGF2R氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树均显示,中华鳖与龟鳖类的亲缘关系最近,与鱼类和两栖动物的亲缘关系相对较远。IGF2和IGF2R基因在中华鳖体内具有广泛的组织表达谱,IGF2基因在精巢中的相对表达量显著高于卵巢(P<0.05,下同),IGF2R基因则恰好相反。IGF2基因在成年中华鳖生长快个体肝脏中的相对表达量显著高于生长慢个体,IGF2R基因的表达模式则相反。在雌二醇(E2)处理下,除雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量在注射6 h时显著升高外,IGF2和IGF2R基因在雌雄个体肝脏中的相对表达量整体上呈下降趋势;MT处理对雄性个体肝脏中IGF2基因的表达无显著影响(P>0.05),但在注射48 h后显著提高雌性个体肝脏中的IGF2基因相对表达量,且显著下调雌性中华鳖肝脏中的IGF2R基因相对表达量。【结论】IGF2和IGF2R基因参与调控中华鳖性腺的发育及成熟,且IGF2R可能通过内化降解IGF2而对中华鳖的生长起负调控作用。此外,IGF2和IGF2R基因会通过下调表达量来响应外源激素的刺激,进而实现对中华鳖生长的调控。

IGF2R基因多态性与结直肠癌和肝癌遗传易感性的相关性研究

目的:探讨IGF2R基因第2020密码子多态(Asn2020Ser)与结直肠癌(CRC)和肝细胞癌(HCC)遗传易感性的关系。方法:采用TaqMan方法检测345例CRC与670名对照以及469例HCC与558名对照的IGF2R Asn2020Ser基因型分布及差异。结果:IGF2R Asn2020Ser基因型分布在CRC-对照和HCC-对照人群间均有显著性差异(P<0.05)。与Asn/Asn基因型相比,Asn/Ser、Ser/Ser和Ser携带者(Asn/Ser和Ser/Ser基因型)的CRC风险分别显著降至0.71倍(95%CI=0.54～0.94,P=0.017)、0.64倍(95%CI=0.42～0.97,P=0.036)和0.69倍(95%CI=0.53～0.90,P=0.008)。类似的,Asn/Ser、Ser/Ser和Ser携带者的HCC风险分别降至0.68倍(95%CI=0.52～0.89,P=0.005)、0.78倍(95%CI=0.52～1.16,P=0.212)和0.70倍(95%CI=0.54～0.90,P=0.006)。结论:IGF2R 2020Ser携带可能对中国人群罹患CRC和HCC具有保护作用。

IGF2R基因多态性与胃癌易感性的相关性

目的 探讨IGF2R基因多态性与胃癌易感性的关系.方法 提取华北地区105例胃癌患者及235例健康查体者外周血基因组DNA,用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reation-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）方法检测IGF2R codon 901和codon 2020位点的基因型分布及差异.结果病例组codon 2020基因型AG、GG的分布频率显著低于对照组,且携基因型AG、GG者胃癌发病风险分别是携AA者的0.65倍（95% CI：0.38~0.89,P＜0.05）和0.72倍（95% CI：0.45~0.91,P＜0.05）.将AG、GG基因型合并计算,则其胃癌发病风险是AA基因型的0.68倍（95% CI：0.45~0.91,P＜0.05）.Codon 901多态性在两组间分布差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 IGF2R基因codon 2020位点多态性可能对中国人群罹患胃癌具有保护作用.

Igf2r及Mest印迹基因在供核细胞中的表达及意义

目的:探讨细胞传代培养对胰岛素样生长因子Ⅱ受体(insulin-like growth factor Ⅱ receptor,Igf2r)和Mest基因表达的影响,以及它们在不同部位来源的成纤维样细胞(fibroblast-like cells)中的表达。方法:利用实时定量PCR法检测印迹基因Igf2r和Mest在来源于鼠耳和尾尖的成纤维样细胞中的表达。结果:在鼠尾成纤维样细胞的传代培养中,随着培养代数的增加,Igf2r的表达减弱,Mest的表达无明显变化;Igf2r在鼠尾成纤维样细胞中的表达高于鼠耳。结论:传代培养影响Igf2r基因的表达,Igf2r在不同部位来源的成纤维样细胞中的表达具有差异,为供核细胞的选择及后续的基因印迹研究奠定了基础。

印记基因Igf2r和RB-1在代谢综合征不孕患者子宫内膜表达水平的研究

目的:研究印记基因Igf2r和RB-1在代谢综合征(MS)不孕患者子宫内膜的表达。方法:选择2011年7月至2011年12月因不孕症来我院生殖中心就诊的MS患者11例作为实验组,代谢正常女性15例作为对照组,收集分泌期的子宫内膜组织,采用实时定量聚合酶链反应方法(RT-PCR)测定子宫内膜组织Igf2r和RB-1的表达水平。结果:Igf2r和RB-1在MS患者和代谢正常妇女子宫内膜中均有表达,与正常女性相比较,MS患者子宫内膜Igf2r表达水平下降(P = 0.0051),RB-1表达水平升高(P = 0.0364),具有显著性差异。结论:MS不孕患者子宫内膜组织印记基因Igf2r表达水平明显下降,RB-1表达水平明显升高,两者可能影响MS患者的子宫内膜容受性。

海南黄牛IGF2R基因单核苷酸多态性及其生物信息学分析

【目的】明确海南黄牛胰岛素样生长因子2受体基因(IGF2R)遗传多态性及其在海南黄牛群体中的遗传分布情况,为进一步揭示IGF2R基因对海南黄牛生长性状的调控机理提供理论依据,也为分子标记辅助选择提供新的候选位点。【方法】构建海南黄牛DNA混池,通过PCR扩增和测序技术对海南黄牛IGF2R基因编码区(CDS)进行基因多态性分析,并以Chromas序列比对筛选出错义突变SNP位点;应用PCR-RFLP对202头海南黄牛个体进行基因型鉴定,同时对筛选到的SNP位点进行连锁不平衡及单倍型分析,评估海南黄牛群体中各单倍型的分布情况;通过生物信息学方法分析各单倍型和SNP位点对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构、蛋白理化性质及蛋白二级结构的影响。【结果】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点,分别为SNP1(g.63977A>G)、SNP2(g.63999T>C)、SNP3(g.69772G>A)和SNP4(g.94987A>C),其中SNP1、SNP2和SNP3位点间呈强连锁不平衡状态。4个SNPs位点在海南黄牛群体中均表现为中度多态性,且处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。海南黄牛群体中存在4种单倍型(F>0.01),分别是H1(ATG)、H2(GCA)、H3(ACA)和H4(GCG);各单倍型及SNP4突变型对海南黄牛IGF2R基因CDS区mRNA二级结构及其最小自由能均有影响。海南黄牛IGF2R蛋白为亲水蛋白,存在跨膜结构和信号肽,其二级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成,α-螺旋和β-转角的占比较小。【结论】在海南黄牛IGF2R基因CDS区共检测到4个错义突变SNPs位点,在海南黄牛群体中均表现为中度多态性,且处于Hardy-Weinberg平衡状态。海南黄牛IGF2R基因SNP位点突变对其mRNA二级结构及稳定性均会造成影响,致使IGF2R蛋白二级结构肽链构象发生改变,进而对海南黄牛生长性状的调控造成影响。

印迹基因Igf2r的甲基化进程与兔卵母细胞直径关系的研究

本研究以3～4月龄兔为研究对象,收集卵母细胞,按直径将其划分为75～95μm、95～105μm、105～115μm3个组,通过亚硫酸盐测序法检测了印迹基因Igf2r的甲基化程度,并运用RT-PCR对Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l、Lsh的表达量进行检测。结果表明,在3组卵母细胞内,Igf2r的甲基化比率依次为15.7%、60%、91.5%,甲基化程度随卵母细胞直径的增加而不断提高。

基于CRISPR/Cas9技术建立IGF2R基因修饰PK-15细胞

作为我国特色的地方种质资源,藏猪对高海拔、低氧、强紫外线辐射等恶劣环境具有良好的适应性,前期研究发现藏猪的IGF2R(insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R)基因在其内含子上有1段274 bp的缺失,且该缺失为藏猪独有的变异,关于IGF2R是否参与藏猪对低氧等恶劣环境的适应性调节的相关研究尚未报道。为了建立IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,研究IGF2R基因对藏猪低氧耐受特性的影响,通过CRISPR/Cas9技术建立基因修饰PK-15细胞系,并通过PCR、实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)、免疫荧光(immunofluorescence,IF)等方法鉴定其分子特征,随后分别利用CCK-8和RT-qPCR、Western-blot对基因修饰细胞进行活力和凋亡基因检测。结果显示,已成功构建IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,IGF2R基因表达量极显著下调(P<0.01)。基因修饰细胞活力在72 h时极显著上升(P<0.01),并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase9)和BCL-2关联X(BCL2-associated X,BAX)蛋白的水平显著下调(P<0.05),并且B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL2)基因的mRNA水平极显著上升(P<0.01)。成功构建了IGF2R基因精确修饰的PK-15细胞系,并初步进行了功能研究,为研究IGF2R基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑猪的制备奠定基础。

细胞复制衰老过程中IGF2R基因表达及H3组蛋白修饰的变化

目的研究细胞复制性衰老过程中胰岛素样生长因子2受体基因（IGF2R）的表达与H3组蛋白修饰谱的变化。方法培养人胚肺成纤维细胞（HPF），以细胞群倍增数（PDL）为23（PDL23）为年轻组细胞，PDL＝50（PDL50）为复制衰老细胞，观察细胞复制衰老过程中生物学性状改变；采用实时定量PCR法观察细胞PDL30、PDL40、PDL50 IGF2R基因的表达，并采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法（chromatinimmunoprecipitation-real time quantitative PCR methods，CHIP-PCR）检测IGF2R基因转录起始区组蛋白修饰（H3-Ac、H3K9-tri—Me、H3K9-Ac和H3K4-tri—Me）的状况。结果与年轻细胞相比，衰老细胞体积变大，增殖能力减弱，细胞周期停滞，衰老特异性肛半乳糖苷酶着色阳性，IGF2RmRNA表达增加（P〈0．05），IGF2RmRNA表达与细胞PDL呈正相关（r=0．871）。相对年轻细胞而言，老年细胞的IGF2R基因在转录起始点上游0．6kb处和转录起始点下游1．2kb处以H3-Ac、H3K9-Ac和H3K4-tri—Me组蛋白修饰为主，而在转录起始点下游1．6～4．0kb处H3K9-Ac修饰降低，H3K9-tri—Me组蛋白修饰升高，但H3K4-tri—Me组蛋白修饰占主要地位。结论IGF2R与细胞衰老程度相关，其基因表达受H3组蛋白修饰调控，表观遗传学参与细胞衰老进程。