鸡抗人B7同源物4(B7-H4)IgY多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人B7同源物4(B7-H4)IgY多克隆抗体,建立合适的双抗体夹心ELISA检测人血清中可溶性B7-H4(sB7-H4)蛋白。方法筛选人源B7-H4蛋白合适的B细胞表位肽免疫新海兰灰蛋鸡,收集鸡蛋纯化鸡抗人B7-H4 IgY抗体;检测抗体的纯度、浓度及效价,并用ELISA、Western blot、流式细胞术验证抗体的特异性和功能;建立双抗体夹心ELISA法并检测临床样本;同时采用商品化的ELISA试剂盒对相同样本进行对比检测。结果制备了鸡抗人B7-H4 IgY抗体并证明该抗体对人B7-H4蛋白有高特异性;采用该抗体检测临床样本发现卵巢癌和良性卵巢肿瘤患者血清中sB7-H4含量明显高于健康人,这与使用商品试剂盒获得的检测结果一致;采用IgY抗体建立的ELISA灵敏度高于商品试剂盒。结论成功制备了鸡抗人B7-H4 IgY多克隆抗体,并用其建立了一种适合检测人血清中sB7-H4蛋白的双抗体夹心ELISA。

抗副溶血弧菌卵黄抗体制备及其与不同血清型菌株交叉反应研究

为探索卵黄抗体对防控凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)病的潜在作用,将2种血清型(O1:KUT和OUT:KUT)的3株副溶血弧菌制备成灭活疫苗,分别免疫产蛋鸡制备卵黄抗体。通过ELISA实验和试管凝集实验,评估了卵黄抗体的效价消长规律、抑菌效果和交叉反应情况。结果显示:3株副溶血弧菌均能诱导高特异性水平的卵黄抗体,抗体凝集效价和ELISA效价的消长趋势相近,均在4免后10~60 d达到卵黄抗体的效价平台期,凝集效价在1∶8以上,ELISA效价在1∶6400以上;卵黄抗体与血清型相同的其他副溶血弧菌发生强烈的交叉ELISA和交叉凝集反应,但与血清型不同的副溶血弧菌有较低的交叉ELISA反应,无交叉凝集反应。研究表明副溶血弧菌能刺激蛋鸡产生高特异性水平的卵黄抗体,对不同血清型菌株不具有交叉保护效果,可为抗副溶血弧菌卵黄抗体产品的开发与应用提供参考。

IgY在抗病毒医学领域中的应用

免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y,IgY)作为一种潜在的治疗性抗体,存在于许多物种内,从低等的两栖类、爬行类到高等动物鸟类等。疫苗的研发成为全球科学家与病毒“赛跑”的竞争主场。疫苗虽能有效预防病毒的感染,降低疾病的发生率和死亡率,但其开发耗时且成本高昂。IgY具有易生产、成本低、起效快的优点,近年来基于IgY的抗体治疗策略得到广泛认可。概述了IgY特性的最新研究和生产技术的进展,综述了IgY在病毒性疾病治疗方面的应用,从而为IgY在病毒感染性疾病治疗领域的应用提供一些启示。

抗杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体制备及ELISA检测方法的建立

为确定杂交鳢(Channa argus×C.maculate)弹状病毒卵黄抗体效价水平消减规律并验证抗体对病毒的中和能力,采用杂交鳢弹状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡,使用醋酸-醋酸钠-辛酸法制备卵黄抗体,建立间接ELISA检测方法以监测卵黄抗体产生过程抗体水平消减情况,以中和试验评估卵黄抗体中和杂交鳢弹状病毒效果。结果显示,ELISA检测方法最佳条件为抗原包被浓度0.5×105.8TCID_(50)/0.1 mL,37℃包被2 h,37℃封闭2 h。与大口黑鲈蛙虹彩病毒卵黄抗体、SPF蛋黄提取物、免疫前蛋黄提取物以及MBC空细胞均无交叉反应。以S/N(sample/negative)>2.1且敏感性最高为标准确定阳性、阴性样品。卵黄抗体于首免后28 d产生效价,四免后达到最高水平,效价为1︰25600,平台期可持续40~60 d,通过中和抗体检测结果证明平台期内抗体中和效价在免疫周期内最高,约为46.3。通过ELISA检测方法对卵黄抗体产生规律进行监测,通过中和检测方法评估卵黄抗体中和病毒效果。高滴度卵黄抗体具有被开发为新型抗杂交鳢弹状病毒生物制品的潜力,杂交鳢弹状病毒卵黄抗体的制备及快速检测方法的构建为该病的防治提供了理论基础和技术手段。

一种改进基尼指数加权的轴承健康指标构建方法

在轴承的状态监测中,构建一个可以准确描述轴承退化趋势且能及时识别早期退化点(EDP)的健康指标(HI)至关重要。目前大多学者提出的健康指标能较好地描述轴承的退化趋势,但不能准确识别早期退化点。提出了一种改进基尼指数(IGI)加权的轴承健康指标构建方法。利用集成经验模态分解(EEMD)对原始信号进行分解,根据各分量的故障特征能量比(FCER),对其进行加权重构得到重构信号;计算重构信号的IGI;将IGI作为重构信号的FCER进行加权计算,得到最终的指标IGI-FCER-HI。通过两个实验验证了所提方法的有效性,并与其他健康指标进行了对比。结果表明,所提方法构建的指标不仅具有良好的单调性和趋势性,而且能准确监测轴承的早期退化点。

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离鉴定及其高免卵黄抗体的制备

为了确定山东某养殖场疑似患有鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)病死鸭的病原,并针对该病原制备高效且安全的卵黄抗体(antibody of yolk,IgY),试验无菌采集病死鸭肝脏组织样品,通过细菌检测、病毒的分离与增殖、特异性基因的RT-PCR鉴定与序列分析及动物回归试验确定病原,采用Reed-Muench法计算半数致死量(LD_(50)),并针对病原制备油乳剂灭活苗,按照免疫程序将其免疫产蛋鸡,收集免疫鸡的鸡蛋,采用生理盐水法提取IgY,测定IgY的中和效价,最后进行动物被动免疫试验,探究IgY对攻毒雏鸭的免疫保护作用。结果表明:将病死鸭肝脏组织划线接种于营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基,培养后均无细菌生长,病死鸭肝脏组织和增殖尿囊液均扩增出Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)特异性基因片段,目的基因与GenBank中的9株DHV-Ⅰ参考株的相应基因序列的相似性为99.1%~99.2%,确定分离出1株DHV-Ⅰ,命名为SD,分离株SD对9日龄鸭胚的LD_(50)为1×10^(-8.25)/0.2 mL。将分离株重新接种健康雏鸭,出现DVH典型的症状,死亡率为100%,提取死亡雏鸭肝脏组织中的病毒RNA,经RT-PCR后能扩增出目的条带,测序结果与分离株SD一致。制备的油乳剂灭活苗稳定性良好,30 min内不分层,雏鸭注射后14 d内生长无异常。制备的IgY抗体中和效价为1∶256,注射IgY后第1~5天攻毒,10 d后的保护率为87.5%~100%,注射IgY后第7天攻毒,10 d后的保护率为75%。说明从发病鸭群肝脏组织中分离出1株高致病性的DHV-Ⅰ,制备的油乳剂灭活苗免疫蛋鸡后获得高效价IgY,对攻毒雏鸭具有很好的免疫保护作用。

抗大肠杆菌卵黄抗体及其纳米粒-微球对大肠杆菌腹泻预防效果评价

试验旨在探讨抗大肠杆菌卵黄抗体(IgY)及其纳米粒-微球对大肠杆菌腹泻的预防效果。采用IgY连续饲喂小鼠8 d,记录并计算小鼠体重变化、血常规变化、器官指数、巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分数;建立小鼠大肠杆菌腹泻模型,将小鼠随机分为IgY组、纳米粒-微球组、空白对照组,分别以口服、腹腔注射、腹腔注射+口服3种方式给药,其中空白对照组以磷酸缓冲盐(PBS)代替IgY。结果显示,IgY饲喂试验中,IgY组小鼠的平均日增重高于对照组,增幅为11.25%;IgY组小鼠的肝脏指数、脾脏指数、巨噬细胞吞噬百分数显著高于对照组(P<0.05),IgY组小鼠的巨噬细胞吞噬指数极显著高于对照组(P<0.01)。在小鼠腹泻预防试验中,IgY与IgY纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌腹泻均具有一定的保护作用,IgY组口服、腹腔注射、腹腔注射+口服3种给药方式下小鼠死亡率分别为16.67%、33.33%、0,IgY纳米粒-微球组对应给药方式的死亡率为83.33%、0、16.67%。研究表明,IgY对小鼠的生长及免疫具有促进作用,抗大肠杆菌IgY及其纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌腹泻有显著的预防作用。

鸡蛋中功能成分的研究

作为一种安全食品,鸡蛋中含有较高的蛋白质及丰富的脂质,是很好的维生素及矿物质的供给源,同时鸡蛋又兼具易于吸收,价格低廉等特点,因此,它被人们誉为维持生命的营养食品。近些年来,全世界有许多国家在鸡蛋的深加工方面特别是对于鸡蛋中蛋黄与蛋清的功能成分的提取方面有了突破性的进展。我国的蛋品工业也有了长足的发展,但是与国外的发展状况相比,差距比较大。主要表现在科学研究偏少,科技含量不高,蛋品深加工产品少等。从世界蛋品产业结构来看,发达国家的蛋品加工量可以占到鲜蛋总量的25%,而我国的蛋品加工量只占到鲜蛋总量的0.7%～1.0%,与发达国家相去甚远[1]。为了开拓蛋品资源加工新途径,提高蛋品的高附加值,促进蛋品消费,综合开发鸡蛋中的功能因子将是一个很好的研究方向。

鸡卵抗体(IgY)理化特性的研究

本文研究了抗脊髓灰质炎病毒Ⅲ型鸡卵抗体（IgY）的理化特性，实验证明IgY在室温条件下能保持活性6个月，经巴氏消毒后抗体活性不丧失，并且具有很好的耐酸性，研究结果提示特异性IgY可作为良好的婴幼儿食品添加剂。

抗轮状病毒IgY的研制

目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒（ＲＶ）免疫球蛋白，预防和治疗婴幼儿ＲＶ感染。方法制备ＲＶ 抗原，通过不同途径免疫母鸡，几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（ＩｇＹ），进行理化学检定及动 物效力实验。结果免疫母鸡均可产生特异性ＩｇＹ，纯度可达９１％以上，产量为４４ｍｇ／蛋；可保护乳鼠兔受ＲＶ攻击； ＩｇＹ耐热、耐酸，室温保存半年、４℃两年效价不变。结论已成功地应用ＲＶ免疫母鸡制备出高效价特异性抗ＲＶ－ＩｇＹ。

鸡卵黄免疫球蛋白Y的性质

用ＥＬＩＳＡ技术研究了鸡卵黄免疫球蛋白Ｙ（ＩｇＹ）对温度、酸碱度、胃蛋白酶、胰蛋白酶及反复冻融的稳定性。结果表明：ＩｇＹ具有良好的热稳定性，对酸碱具有一定的耐受力，对胃蛋白酶具有良好的抵抗能力（ｐＨ＞４）。对胰蛋白酶非常敏感，经１ｈ酶解处理，ＩｇＹ的结合活性完全丧失。ＩｇＹ具有很好的耐反复冻融的特性，即使经过５次反复冻融，其抗原结合活性也几乎未受损失。

鸡卵黄抗体IgY的分离纯化及鉴定

采用水溶稀释法结合硫酸钠二次盐析沉淀法分离纯化鸡卵黄中蛋白IgY,实验中比较了不同pH值的水溶稀释液对卵黄除脂效果的影响;并采用SDS-PAGE及western blotting对提取产物进行鉴定。结果显示,pH值5.2水溶稀释液除脂效果最好,IgY得率最高。实验优化了鸡卵黄抗体IgY分离纯化技术,得到的IgY产量高、纯度高,特异性强;此外,水溶稀释法制备IgY具有利用小体积样品获得大量蛋白及纯化效率高的优点。

鸡蛋黄抗体IgY的急、慢性毒性实验

目的 :通过观察实验动物使用鸡蛋黄抗体IgY后的急、慢性毒性反应 ,评估鸡蛋黄抗体IgY的安全性。方法 :昆明小鼠 ,雌雄各 10只 ,鸡蛋黄抗体IgY喷漱液经口灌胃连续 1周 ,并记录动物中毒症状及死亡情况。Wistar大鼠 80只 ,分为受试物低、中、高剂量组 ,经口灌胃 30d后 ,观察大鼠血液生化指标及脏器变化。结果 :1周内小鼠未见明显中毒症状和死亡发生。 30d后大鼠临床检查、血液、生化、脏器组织病理学等项目测定均无异常。结论 :按急性毒性分级 ,IgY属无毒级类物质 ,且无慢性毒性表现。

抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体治疗效果研究

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)免疫原免疫产蛋母鸡,收集卵黄提纯制备高效价卵黄抗体,作为治疗剂应用于试验感染腹泻仔猪,结果显示卵黄抗体具有显著的治疗效果,治疗组腹泻症状明显减轻,多数在5d后恢复正常,死亡率仅有16 7%;而对照组呈水样腹泻,最后脱水衰竭而死,死亡率为100%,两者差异极显著。

卵黄抗体IgY检测血吸虫病人循环抗原的初步研究

目的探讨抗可溶性虫卵抗原(SEA)卵黄抗体(IgY)检测血吸虫循环抗原的应用价值。方法以纯化的鸡IgY作为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B为检测抗体的双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(S-ELISA)检测急、慢性血吸虫病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法(SEA-ELISA)作比较。结果S-ELISA测得SEA浓度(y)与吸光度(A450)值(x)呈明显的正相关(y=459.22x-108.14,r=0.9481)。急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100.00%(9/9),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84.44%(38/45),健康人的特异性为96.00%(48/50)。两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论S-ELISA具有较好的敏感性和特异性,可用于血吸虫病免疫诊断。

抗金黄色葡萄球菌IgY的酶解稳定性及活性研究

目的:考察抗金黄色葡萄球菌特异性IgY的酶解稳定性和酶解产物的活性。方法:以灭活的金黄色葡萄球菌免疫产蛋母鸡,抗体经水稀释及盐析分离纯化。抗体在不同条件下经胃蛋白酶或胰蛋白酶消化。抗体及酶解产物的特异性和活性分别用ELISA法和凝集法检测,酶解产物用SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。结果:免疫产生的抗体具有特异性,能与金黄色葡萄球菌凝集而抑制其生长。分离纯化后抗体纯度与标准IgY相近。IgY在pH<4时完全酶解;pH等于4时部分酶解生成Fab片断,具有特异性和凝集活性;pH>4时,抗体稳定,不发生酶解。结论:抗金黄色葡萄球菌特异性IgY及其酶解生成的Fab片断,具有特异性和抑菌活性,有望代替抗生素用于细菌感染性疾病的治疗。

水稀释法分离卵黄IgY

用水稀释法分离蛋黄中的免疫球蛋白 Ig Y,研究稀释度、稀释液 p H和温浴时间对分离效果的影响 .结果表明 ,用 7倍无菌水稀释蛋黄 ,调节 p H=5.0 ,在 4℃下温浴 5h,可获得较好的分离效果 ,Ig Y的回收率为 92 % .分离的 Ig Y用硫酸铵和硫酸钠盐析纯化 ,Ig Y的纯度达到 97% ,回收率达到 94% .通过对 Ig Y稳定性的研究表明 ,Ig Y对热、酸和冻融有良好的稳定性 .

鸡新城疫卵黄抗体IgY的分离提纯研究

本文对母鸡经鸡新城疫疫苗免疫接种后产生并富集在卵黄中的抗体IgY的提取纯化工艺条件进行了研究与优化,确定了去脂、提取抗体最佳工艺为:卵黄液用0.05mol/L,pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液1∶9倍稀释,搅拌15min,4℃静置10小时,抗体回收率为90%,去脂率为99%;该提取液用40%饱和度的硫酸铵盐析,得到的盐析液抗体回收率为82%,纯度达到69%。盐析液经截留分子量为100KD的有机陶瓷膜超滤后,截留液抗体回收率达到92%,纯度为85%。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应。将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法。采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率达86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%。阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性。