扶正解毒方含药血清对小鼠肺泡巨噬细胞和II型肺泡上皮细胞共培养的炎症调控作用研究

目的通过探讨扶正解毒方在小鼠肺泡巨噬细胞和II型肺泡上皮细胞共培养体系中的炎症调控作用,阐明其治疗急性肺损伤的机制。方法选取SD大鼠20只灌胃扶正解毒方颗粒剂,连续7d后处死大鼠制备扶正解毒方含药血清;采用LPS 1μg/mL对小鼠肺泡巨噬细胞MH-S进行预处理,6h后给予不同浓度扶正解毒方含药血清干预,采用MTT法检测MH-S的增殖情况;在Transwell中建立小鼠肺泡巨噬细胞MH-S(上室)和II型肺泡上皮细胞MLE-12(下室)共培养体系,24h后给予1μg/mL LPS和(或)不同浓度(5%、10%、15%)扶正解毒方含药血清干预,分别采用分光光度计、ELISA、荧光定量PCR、Western-blot测定小鼠II型肺泡上皮细胞层通透性、共培养上清中氧化应激分子、炎性细胞因子、炎性介质mRNA水平、PI3K/Akt蛋白表达。结果不同浓度的扶正解毒方均抑制LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞增殖(P<0.05);共培养体系中,各浓度的扶正解毒方含药血清均可降低小鼠II型肺泡上皮细胞通透性(P<0.001),中、高剂量组能够下调共培养上清中氧化应激分子NO和ROS、炎症因子IL-6、TNF-α和IL-1β以及炎症介质iNOS、COX-2和MCP-1 mRNA水平(P<0.05),此外含药血清能够抑制共培养体系小鼠肺泡巨噬细胞中的PI3K/Akt信号通路磷酸化(P<0.05)。结论在LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞和II型肺泡上皮细胞共培养体系中,扶正解毒方可通过抑制PI3K/Akt信号通路活化,下调氧化应激分子和炎症介质表达,抑制M1型巨噬细胞增殖,改善II型肺泡上皮细胞屏障功能。

瘦素/ERK信号在云锡矿粉诱导大鼠II型肺泡上皮细胞转化中的作用

背景与目的目前,云南个旧锡矿有大量矿工从事开采工作,这种职业环境与接触粉尘颗粒、重金属、多环芳烃和放射性氡有关,大大增加了患肺癌的风险。本研究旨在探讨在云锡矿粉诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(immortalized rat alveolar cells type Ⅱ,RLE-6TN)恶性转化过程中,瘦素(leptin)及其介导的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)信号通路所起的作用。方法采用200μg/mL的云锡矿粉隔代毒染RLE-6TN至第9代,建立毒染细胞模型,命名为R_(200)细胞,正常培养组命名为R细胞,通过Western blot法检测两种细胞leptin受体的表达情况。通过MTT法筛选出leptin及丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)抑制剂(U0126)对R_(200)细胞的最佳作用浓度。自第20代起,将R组、R_(200)组细胞分别与leptin及MEK抑制剂U0126共培养,对各组细胞的形态改变进行观察,并利用苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色技术鉴别第40代细胞的形态学差异,通过刀豆凝集素A(concanavalin A,ConA)及锚着独立性生长实验法检测细胞恶性转化情况。通过Western blot法检测leptin作用后上皮细胞ERK信号通路的变化。结果R组和R_(200)组细胞均表达leptin受体(OB-R)。与R_(200)组比较,当leptin浓度达100 ng/mL时,其促增殖效应最为显著,30μmol/L U0126可抑制毒染细胞R_(200)增殖,与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。自第25代起,leptin诱导的R_(200)组(R_(200)L组)细胞形态发生变化,至第30代出现恶性转化,至第40代时恶性转化特征明显;而R_(200)组细胞及U0126诱导的R_(200)组(R_(200)LU组)细胞则在第40代时才出现恶性转化特征。R_(200)L组细胞凝集速度较R_(200)LU组快,其余各组细胞P30出现凝集,且随ConA浓度增加,细胞凝集速度加快。R_(200)L组细胞自P40可见克隆形成,克隆形成率为2.25‰±0.5‰,R_(200)LU组及R_(200)组未见克隆集落。R_(200)L组细胞pERK表达增强;加入U0126阻断后,R_(200)L组细胞pERK磷酸化水平降低。结论Leptin可以促进云锡矿粉毒染肺上皮细胞的恶性转化,ERK信号通路可能是其促进云锡矿粉引发的肺泡Ⅱ型上皮细胞转化的重要途径。

血管紧张素Ⅱ诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞表达IL-6和IL-8

目的观察血管紧张素Ⅱ对Ⅱ型肺泡上皮细胞炎性因子表达的影响。方法用RT-PCR检测IL-6和IL_8mRNA的转录水平，用ELISA检测培养基中IL－6和IL－8的分泌量。结果IL-6和IL-8mRNA转录水平和蛋白分泌量在血管紧张素Ⅱ浓度范围（10^-9～10^-7M）内随着浓度的增加而增加，但是在血管紧张素Ⅱ10^-5M时，IL-6和IL-8mRNA转录水平和蛋白分泌量都出现了明显的下降。10^-7M的血管紧张素Ⅱ处理Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）不同时间（0，6h，12h，24h）后，发现在6h时IL06和IL-8 mRNA转录水平最高。结论血管紧张素Ⅱ能够诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞（A549）表达炎性因子，可能在机械通气诱导肺损伤的发病机制中起重要作用。

1,25-(OH)_2D_3对肺纤维化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞中Ca^(2+)浓度和PI3K/AKT/mTOR通路的影响

目的特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种慢性炎症性疾病,病因不明,缺乏有效的治疗方法。文中旨在探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞中Ca^(2+)和PI3K/AKT/mTOR通路在大鼠IPF中的作用,以及1,25-(OH)_2D_3对Ca^(2+)浓度和PI3K/AKT/mTOR通路的影响。方法 150只雄性SD大鼠随机分为:预防组(对照组Ⅰ、模型组Ⅰ、给药组Ⅰ,每组20只)和治疗组(对照组Ⅱ、模型组Ⅱ、给药组Ⅱ,每组30只)。对照组Ⅰ/Ⅱ行气管暴露手术,气管内给以200μL/只的无菌等渗盐水,并分别于第2和14天开始腹腔注射等渗盐水(200μL/只);模型组Ⅰ/Ⅱ气管内灌注博来霉素(5 mg/kg),并分别于手术后第2和14天开始腹腔注射维生素D3的溶剂(0.1%乙醇和99.9%的丙二醇,1μL/g体重);给药组Ⅰ/Ⅱ气管内灌注博来霉素(5 mg/kg),并分别于手术后第2和14天开始腹腔注射1,25-(OH)_2D_3(2μg/kg体重)。大鼠气管内注射博来霉素建立IPF模型,给药组腹腔注射1,25-(OH)_2D_3进行预防和治疗。检测各组大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量,分离肺泡Ⅱ型上皮细胞并用Fluo-3AM荧光负载,激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca^(2+)浓度。RT-PCR方法检测PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达水平。结果模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中大鼠肺组织中羟脯氨酸的含量、肺泡Ⅱ型上皮细胞内Ca^(2+)浓度以及PI3K、AKT、mTOR mRNA表达,在各时间点与相应对照组Ⅰ/Ⅱ相比均明显升高(P<0.05或P<0.01);给药组Ⅰ/Ⅱ与模型组Ⅰ/Ⅱ相比,上述指标均有显著降低(P<0.05或P<0.01)。模型组Ⅰ/Ⅱ和给药组Ⅰ/Ⅱ中Ca^(2+)浓度与PI3K、AKT、mTOR mRNA表达之间具有显著正相关(r=0.598 8、r=0.623 0、r=0.6603,P<0.01;r=0.7012、r=0.6323、r=0.7403,P<0.01)。结论 PI3K-AKT-mTOR通路在大鼠IPF的发生发展中起重要作用,1,25-(OH)_2D_3可以降低肺泡Ⅱ型上皮细胞内Ca^(2+)的浓度,抑制PI3K-AKT-mTOR通路,进而抑制IPF的发生发展。

NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用机制研究

目的:探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体介导的细胞焦亡在大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用及其机制。方法:常氧培养AEC Ⅱ,并建立H/R损伤模型,随机分为:正常组(Con组,不做处理)、H/R组、NLRP3炎症小体激动剂(脂多糖和ATP,LPS+ATP)组(在H/R组的基础上用NLRP3炎症小体激动剂)及NLRP3炎症小体抑制剂(MCC950)组(在H/R组的基础上用NLRP3炎症小体抑制剂)。实验结束后,收集细胞,采用CCK-8法检测各组细胞活力;试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)和caspase-1活性;免疫荧光染色法观察各组细胞NF-κB和caspase-1表达变化;Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NF-κB、NLRP3、gasdermin D(GSDMD)和白细胞介素1β(IL-1β)的表达水平。结果:与Con组相比,其余3组细胞活力显著下降(P<0.05),LDH释放显著增加(P<0.05),caspase-1活性显著升高(P<0.05),NF-κB和caspase-1荧光表达显著增加(P<0.05),细胞焦亡相关蛋白NF-κB、NLRP3、GSDMD-N和IL-1β表达显著增加(P<0.05);与H/R组相比,MCC950组细胞活力显著升高(P<0.05),LDH释放显著减少(P<0.05),caspase-1活性显著下降(P<0.05),NF-κB和caspase-1荧光表达显著减少(P<0.05),NF-κB、NLRP3、GSDMD-N和IL-1β蛋白表达显著减少(P<0.05),而LPS+ATP组与H/R组相比,结果则与MCC950组呈相反趋势(P<0.05)。结论:H/R可激活NF-κB信号通路,上调细胞焦亡相关蛋白表达,导致大鼠AEC Ⅱ损伤;NLRP3炎症小体抑制剂MCC950可减轻H/R引起的大鼠AEC Ⅱ损伤,其机制可能与其抑制NF-κB,减轻细胞焦亡有关。

炎调方通过Fas/FasL通路抑制ATⅡ细胞凋亡的研究

目的体外观察炎调方通过Fas/FasL通路延缓LPS诱导II型肺泡上皮细胞(ATII)凋亡的作用。方法原代分离与培养ATII细胞,运用脂多糖(LPS)干预ATII进行体外ALI细胞造模,结合药物血清技术,观察炎调方对ATII细胞凋亡的影响。Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测ATII细胞凋亡率,Western blot方法检测Fas、FasL、caspase-8、caspase-3表达。结果 LPS降低了ATII细胞存活率,炎调方对LPS诱导的细胞凋亡有显著的抑制作用;LPS能明显激活caspase-8和caspase-3活性,提高Fas和FasL的水平;炎调方能减弱caspase-8和caspase-3活性,降低Fas和FasL表达。结论炎调方能延缓ATII凋亡,其机制可能与抑制Fas/FasL通路活性有关。

邻苯二甲酸二乙基己基酯对子代大鼠肺损伤的作用及其机制

目的:研究邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)对出生后第21天(PND21)子代大鼠肺脏的损伤作用及其机制。方法:受孕SD大鼠24只,随机均分为正常对照(NC)组、低剂量染毒(L)组、中剂量染毒(M)组和高剂量染毒(H)组,从怀孕第1天至产后PND21,每天给予不同剂量DEHP(0、10、100、750 mg·kg-1·d-1)母鼠灌胃。获取PND21子代大鼠肺泡巨噬细胞(AM)并培养。分别测定AM内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性;Masson染色及光镜、电镜观察肺组织病理学改变;免疫组化和RT-PCR检测肺组织骨桥蛋白(OPN)及其基因表达。结果:H组肺泡隔增厚,肺间质细胞增多,肺泡数目减少;M、H组肺细小动脉以及肺间质胶原纤维沉积较NC组增多,以H组最为显著;超微结构显示M、H组肺泡II型上皮细胞核固缩,板层小体空泡化,线粒体肿胀、变圆,嵴变短;M、H组AM内SOD和GSH-PX酶活性明显低于NC组(P<0.05);M、H组OPN及其mRNA表达较NC组显著上调(P<0.05),L组与NC组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:DEHP对PND21子代大鼠肺损伤主要表现为肺间质纤维化,肺泡II型上皮细胞损伤、AM抗氧化能力的下降及OPN的表达升高可能是其机制。