人增生性瘢痕成纤维细胞IKKβ特异性siRNA表达载体构建及表达

目的:体外合成并筛选人增生性瘢痕成纤维细胞特异性IKKβ-siRNA,构建其表达载体并检测其表达.方法:化学合成3条IKKβ-siRNA,分别转染体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,采用RT-Q-PCR筛选出特异性IKKβ-siRNA,并采用PU6质粒构建载体,RT-Q-PCR检测其表达.结果:合成的3条IKKβ-siRNA链中,仅第二条有明显抑制IKKβ的mRNA表达的作用,并通过酶切鉴定和测序结果证明成功构建IKKβ-siRNA载体,经转染靶向IKKβ-siRNA的成纤维细胞,IKKβ的表达在转染后24h及48h均受到抑制.结论:应用RT-PCR可筛选出针对人增生性瘢痕成纤维细胞的特异性IKKβ-siRNA;可构建具有干扰效果的IKKβ-siRNA表达载体,转染后可以降低IKKβ的表达.

IKKβ真核表达载体的构建及表达

目的构建核转录因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of kappa B kinase,IKK)β真核表达载体,以便进一步探讨其生物学作用。方法从人正常肝细胞L02中提取RNA,并利用IKKβ特异性引物通过RT-PCR方法扩增了IKKβcD-NA,并克隆入pcDNA3载体中,构建重组载体pcDNA3-IKKβ。将重组载体转染入HEK293细胞中,并通过免疫印迹方法检测IKKβ的表达。结果酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;免疫印迹结果显示,瞬时转染重组质粒的人胚肾细胞HEK293中可有效表达IKKβ。结论本研究成功构建了IKKβ真核表达载体,并能够在真核细胞中进行表达,为进一步研究IKKβ的生物学功能奠定了基础。

IKKα基因靶向shRNA真核表达载体的构建及表达

目的:研究短发夹RNA(shRNA)真核表达载体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中对IKKα基因表达的抑制作用.方法:设计3条靶向IKKα的shRNA,经退火成互补双链,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中构建重组载体,经酶切鉴定和测序确认后,将3个重组表达载体转染到HUVECs,利用Western blot检测并筛选出抑制效果最好的重组表达载体.结果:通过酶切鉴定和测序分析,靶向IKKα的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体构建成功,Western blot结果显示pGPU6/GFP/Neo-shRNA3可有效抑制高糖诱导HUVECs中IKKα基因的表达,抑制率为70.6%.结论:靶向IKKα基因的shRNA真核表达载体构建成功,且能有效抑制HUVECs中IKKα基因的表达.

转染Smad3-siRNA的活化肝星状细胞Smad3表达及细胞外基质分泌量变化

目的转染Smad3-siRNA的活化肝星状细胞（HSCs）Smad3表达及细胞外基质分泌量变化。方法利用生物软件进行Smad3 mRNA模拟,选择合适的靶位点,使用p Silencer3.1-H1-hygro载体表达Smad3特异性siRNA。将Smad3-siRNA真核表达载体转染HSC-T6细胞株,将HSC-T6细胞接种到24孔培养板,待细胞生长融合达60%~80%后,每3孔为1组,共分为4组,HSC-T6组细胞未经过质粒转染;空白质粒组细胞经过不含Smad3-siRNA的空白质粒转染;1μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有1μg Smad3-siRNA的质粒转染;2μg Smad3-siRNA转染组细胞经过含有2μg Smad3-siRNA的质粒转染。应用RT-PCR法、Western blotting法分别检测Smad3 mRNA和蛋白,同时检测细胞上清胶原Ⅲ。结果成功构建siRNA表达克隆。HSC-T6组、空白质粒组、1μg Smad3-siRNA组、2μg Smad3-siRNA组的Smad3 mRNA相对表达量分别为0.98±0.06、0.98±0.10、0.72±0.10、0.31±0.15,Smad3蛋白相对表达量分别为0.98±0.01、0.96±0.02、0.73±0.03、0.30±0.02,胶原Ⅲ含量分别为33.11±0.45、33.55±1.00、17.93±1.05、11.80±1.31,1μg Smad3-siRNA组、2μg Smad3-siRNA组分别与HSC-T6组比较,1μg Smad3-siRNA组、2μg Smad3-siRNA组分别与空白质粒组比较,1μg Smad3-siRNA组与2μg Smad3-siRNA组比较,P均〈0.05。结论在体外实验中真核表达载体Smad3-siRNA可有效地抑制HSCs中Smad3的表达,并可减少激活的HSCs分泌细胞外基质。

人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。

双基因共表达腺相关病毒穿梭质粒的构建与鉴定

目的合成和筛选nog066-siRNA干扰片段，克隆神经生长因子-β（NGF-β），构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。方法设计针对nog066的siRNA，插入载体pGenesil-1．1，转染大鼠胶质瘤C6细胞，通过RT-PCR和Western-blot检测筛选有效的干扰质粒；培养人MIApaca-2细胞，提取总RNA，进行RT-PCR得到人NGF-β基因，插入T-easy载体；将pGenesil-1．1与pAAV-MCS进行重组，得到含u6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV—U6／CMV—EGFP；将nog066一siRNA和NGF-β分别插入pAAV-U6／CMV-EGFP中，构建含nog066-siRNA和NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿梭质粒。结果干扰质粒pGenesil-nogo66-siRNA测序显示十扰序列正确；RT-PCR结果显示转染后各条带相对亮度有差异，转染pGenesil-nog066-siRNA-1和pGenesil-nog066-siRNA-2使nogo基因表达降低；Western-blot结果显示转染pGenesil-nogo66-siRNA、1使NOGO蛋白表达下降73％，转染pGenesil-nog066-siRNA-2使NOGO蛋白表达下降78％，与未转染组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）；质粒T-easy-NGF-β酶切可见3000bp、736bp条带，测序显示基因序列正确；酶切pAAV-U6／CMV-EGFP、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-EGFP町见4300bp、800bp条带．转染细胞后均可见绿色荧光蛋白表达；酶切pAAV-U6／CMV-NGF-β、pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β可见4300bp、736bp条带；质粒pAAV-U6-nog066-siRNA／CMV-NGF-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建了含有nog066-siRNA与NGF-β双基因的重组腺相关病毒穿格质粒，为深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础。