SIRT2在小鼠1-细胞期受精卵中的表达和定位研究

目的:探讨沉默信息调节蛋白2(SIRT2)在小鼠1-细胞期受精卵的表达和定位。方法:利用qRT-PCR、Western blotting分别检测SIRT2在小鼠1-细胞期受精卵发育全过程中mRNA和蛋白表达谱;采用细胞免疫荧光法观察SIRT2和α-tubulin的共定位情况。结果:小鼠1-细胞期受精卵SIRT2 mRNA和蛋白表达变化趋势一致,均由G 1向G 2期过渡时表达水平升高;由G 2期向M期过渡时表达水平下降(P<0.05)。在G 2期向M期过渡过程中,SIRT2的定位由细胞质向细胞核转移,于M期中期进入细胞核并定位于纺锤体,在M期后期重新定位于细胞皮质。结论:SIRT2蛋白在小鼠1-细胞期受精卵中的表达呈细胞周期时相依赖性,在1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂间期(G 1、S、G 2)中细胞质内表达增加,积累的SIRT2在某种条件下进入细胞核调节纺锤体微管动力学,在G 2/M过渡期发挥作用。

蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的表达及其定位

目的:检测小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期中蛋白激酶Wee1B的表达水平及其定位水平,初步阐明Wee1B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法:超排卵获得小鼠1-细胞期受精卵,收集卵细胞后用RT-PCR和Western blotting方法检测Wee1B的mRNA和蛋白表达水平;放射自显影测定Wee1B活性;间接免疫荧光观察Wee1B在各个细胞时期的定位。结果:小鼠1-细胞期受精卵G1、S、G2和M期Wee1BmRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);S、G2和M期Wee1B蛋白表达量与G1期比较差异有统计学意义(P<0.01);与G1期比较,S、G2期Wee1B活性逐渐增高(P>0.05,P<0.01),M期Wee1B活性迅速下降(P<0.01)。G1期和S期细胞Wee1B蛋白偶联的红色荧光信号主要集中分布于细胞核,但在G2期细胞红色荧光信号弥散分布于细胞浆,在M末期和2-细胞期可见红色荧光信号又重新分布于细胞核,细胞浆内荧光减弱。结论:蛋白激酶Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵各个细胞周期动态表达,Wee1B蛋白存在核浆转位,Wee1B的定位变化可能调控小鼠受精卵有丝分裂。

火针对脊髓损伤模型大鼠IL-1β、Caspase-3蛋白表达的影响

目的探讨火针对脊髓损伤(SCI)模型大鼠Caspase-3、IL-1β蛋白表达的影响。方法选择SD大鼠80只,随机分为假手术组、模型组、火针组与毫针组,采用改良Allen's法建立急性SCI模型,经不同针刺方法干预后,在不同时段取材并通过免疫组化SABC法检测Caspase-3、IL-1β蛋白表达。结果模型组中,SCI大鼠脊髓内IL-1β与Caspase-3的蛋白表达明显增高;两个针刺干预组中,IL-1β与Caspase-3的蛋白表达明显降低,其中火针干预组更为明显。结论火针可降低SCI模型大鼠IL-1β、Caspase-3蛋白表达。

小鼠睾丸膜联蛋白A1的克隆、表达及定位

目的:克隆、表达小鼠睾丸膜联蛋白A1,并研究其在睾丸中的定位。方法:利用RT-PCR技术从小鼠睾丸组织中扩增膜联蛋白A1的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T。以亲和层析法纯化蛋白免疫家兔制备多抗,并做睾丸切片免疫组织化学检测。结果:重组质粒测序结果表明,插入片段与小鼠膜联蛋白A1的序列完全一致。K802重组菌高效表达出相对分子质量为63 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%。多抗效价达1∶102 400,可特异识别重组蛋白。免疫组织化学显示膜联蛋白A1主要分布于精原细胞核、精子细胞顶体帽及精子胞质残余体内。结论:成功克隆、表达了小鼠膜联蛋白A1基因;膜联蛋白A1在睾丸生精细胞中的不同分布预示其可能与生精过程有关。

阴道毛滴虫Rab1a重组蛋白的表达和细胞内定位

目的制备阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)Rab1a重组蛋白及其多克隆抗体,并对TvRab1a蛋白进行阴道毛滴虫的细胞内定位。方法将我们已构建的pQE80L/TvRab1a重组表达质粒转入大肠埃希菌E.coliM15,在IPTG诱导下表达重组蛋白,经Ni-NTA亲和柱层析后获得纯度较高的TvRab1a的重组蛋白;用经复性处理的重组蛋白免疫动物,获得TvRab1a重组蛋白抗血清,免疫印迹WesternBlot鉴定抗血清。采用荧光免疫细胞化学对TvRab1a蛋白进行细胞内定位。结果WesternBlot分析显示,TvRab1a重组蛋白可与豚鼠的抗TvRab1a血清反应,同时该抗血清在滴虫提取蛋白中检测到与预测TvRab1a分子量一致的条带;免疫荧光化学检测发现TvRab1a分布于细胞核周围的高尔基复合体与内质网。结论获得的抗TvRab1a蛋白的多抗血清可用于TvRab1a基因功能的研究;TvRab1a功能场所位于高尔基复合体与内质网。

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(t SID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-t SID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-t SID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。

缺氧诱导因子-1αmRNA和蛋白在妊高征胎盘组织中表达定位

目的 :探讨缺氧诱导因子 1α( HIF- 1α)在妊高征胎盘组织细胞中的定位。方法 :收取 1 0例妊高征孕妇的胎盘组织 ,应用免疫组织化学方法 ,观察 HIF- 1α蛋白在妊高征胎盘组织细胞中的定位表达 ;应用原位杂交的方法 ,观察 HIF- 1α m RNA在妊高征胎盘组织细胞中的定位表达。结果 :在妊高征胎盘中 ,HIF- 1α蛋白主要表达在合体滋养细胞、血管内皮细胞的胞核和胞浆中 ;HIF- 1 α m RNA主要表达在合体滋养细胞和血管内皮细胞的胞浆中。结论 :HIF- 1 α在妊高征胎盘组织中表达主要集中在胎盘的合体滋养细胞和血管内皮细胞。妊高征胎盘中合体滋养细胞和血管内皮细胞表达 HIF- 1 α。

溃结安康汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织IL-1β的作用及蛋白表达的影响

目的:研究溃结安康汤对溃疡性结肠炎大鼠白介素(IL)影响及其作用机制。方法:健康Wistar大鼠,随机分为空白对照组、模型组、补脾益肠丸组、SASP(柳氮磺胺吡啶)组、溃结安康汤组。TNBS/乙醇法建立溃疡性结肠炎大鼠模型。分组灌胃治疗后,检测溃结大鼠结肠组织IL-1β含量和IL-1β蛋白表达。结果:模型组与正常组比较,IL-1β含量升高、蛋白表达升高,具有统计学意义(P<0.05);补脾益肠丸组、SASP组、溃结安康汤组与模型组比较IL-1β含量下降、蛋白表达下降,具有统计学意义(P<0.05);溃结安康汤组与补脾益肠丸组、SASP组比较,IL-1β含量下降明显、蛋白表达下降明显,具有统计学意义(P<0.05)。结论:溃结安康汤可以降低溃疡性结肠炎大鼠模型中结肠组织IL-1β含量和蛋白表达。

IL-1β和TNF-α对体外培养的人RPE细胞FasL蛋白及mRNA表达的影响

目的:观察IL-1β和TNF-α对培养的人RPE细胞FasL蛋白、mRNA表达的影响。方法:流式细胞仪检测暴露于IL-1β和/或TNF-α的RPE细胞FasL的表达,并用mRNA斑点杂交分析mRNA的改变。结果:流式细胞仪显示23.4%培养的RPE细胞表达FasL。IL-1β,TNF-α和二者联合应用后FasL阳性率则分别为25.7%,9.7%和17.2%。mRNA斑点杂交亦证实TNF-α下调FasLmRNA的表达。结论:TNF-α可下调体外培养的人RPE细胞FasL蛋白,mRNA的表达。

火鸡组织滴虫ME 1基因的原核表达及其定位分析

为研究火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)依赖性苹果酸酶(ME 1)的抗原性及其在火鸡组织滴虫中的定位,本研究根据本实验室前期对火鸡组织滴虫ME 1基因的测序结果设计引物,以虫体cDNA为模板,经RT-PCR扩增火鸡组织滴虫ME 1(HmME 1)基因,结果显示HmME 1基因全长1182 bp,将其克隆至pET28a(+)构建重组表达载体后转化BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白rHmME 1,经SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示,rHmME 1以可溶形式存在,相对分子量约为46 ku,且纯化的rHmME 1条带单一,浓度为0.4 mg/mL。将该纯化的rHmME 1免疫小鼠,制备该重组蛋白的鼠抗血清(多克隆抗体),采用间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价,结果显示制备的多克隆抗体效价为1∶409600。采用western blot分别检测rHmME 1与制备的鼠源rHmME 1阳性血清和鸡源火鸡组织滴虫阳性血清的反应原性,以及鉴定虫体天然表达的HmME 1蛋白与制备的鼠源rHmME 1阳性血清的反应原性,结果显示rHmME 1蛋白能同时被鸡源火鸡组织滴虫阳性血清及鼠源rHmME 1阳性血清特异性识别,制备的鼠源rHmME 1阳性血清也可以与虫体天然表达的HmME 1蛋白反应。利用间接免疫荧光试验(IFA)对虫体内的HmME 1蛋白进行定位分析,结果显示HmME 1广泛存在于火鸡组织滴虫的胞质内。上述结果首次表明,HmME 1的反应原性及抗原性均较强,可以作为火鸡组织滴虫重组亚单位疫苗研制的潜在靶标,该结果为进一步研究火鸡组织滴虫的致病机制及疫苗研制奠定了基础。

怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因克隆、亚细胞定位和组织表达分析

通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因的核心片段,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因,并采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR进行序列分析和器官表达分析。结果表明,怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1基因cDNA总长度为888 bp,G+C含量为51.58%;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1由295个氨基酸组成,分子量33173.36 u,等电点9.16,为疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋(43.73%)、β-片层(21.69%)、无规则卷曲(34.58%)构成;三级结构为单体;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1主要存在于内质网、内质网-质膜、细胞外、细胞质、线粒体和质膜中;怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1在进化上与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)、Triticum turgidum subsp.durum(硬粒小麦)、Hordeum vulgare(大麦)的亲缘关系较近,尤其是与Aegilops tauschii subsp.tauschill(节节麦)烟草病毒增殖蛋白1在进化上具有最高的亲缘关系。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明,烟草病毒增殖蛋白1定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,烟草病毒增殖蛋白1基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性,怀玉2号在叶中表达量最高,怀玉1号在茎中表达量最高。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白1具有典型烟草病毒增殖蛋白1的结构特征,氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高,在进化上高度保守,对进一步揭示该酶生物学功能具有重要意义。

不同浓度IL-1对人的软骨细胞基质金属蛋白酶1 mRNA表达的影响

目的 观察不同浓度白介素 - 1 β (IL - 1 β)对体外培养人的关节透明软骨细胞基质金属蛋白酶 1 (MMP - 1 )mRNA表达的影响。方法 体外培养的人的透明软骨细胞 ,随机分为 4组 ,A组为空白对照组 ;B、C、D组分别加入 1ng/ml,1 0ng/ml,1 0 0ng/mlIL - 1 β1作用 1 2h。采用逆转录PCR (RT -PCR)方法及实时荧光定量PCR (FQ -PCR)的方法 ,观察透明软骨细胞MMP - 1mRNA的表达状况 ,比较不同剂量IL - 1 β作用下传代培养的人的透明软骨细胞MMP - 1基因表达与正常软骨细胞相应基因表达的关系。结果 正常人的软骨细胞均有MMP - 1但表达量较低。IL - 1 β浓度为 1ng/ml,1 0ng/ml,1 0 0ng/ml作用 1 2h ,对MMP - 1mRNA调节作用存在明显的剂量依赖关系 ,各组之间存在显著性差异 ,MMP - 1的含量分别为正常组的 1 6、 2 3、 4 2倍。结论 研究表明 ,IL - 1 β对人的软骨细胞MMP -

兔精子发生过程中cyclin B1基因表达和蛋白定位的发育阶段依赖性

利用原位杂交和免疫组化等方法 ,研究兔精子发生过程中生精细胞cyclinB1mRNA的表达和蛋白定位特点。结果显示 :兔生精上皮中cyclinB1mRNA主要分布在初级精母细胞中 ,直至圆形精子细胞仍然存在 ,于精子细胞的变态过程中逐渐消失。在伸长的精子细胞和精子中未检测出cyclinB1mRNA。CyclinB1蛋白在进入分裂期的精原细胞和精母细胞中表达 ;在圆形精子细胞和伸长的精子细胞中呈现大量的cyclinB1蛋白。上述结果表明 :在兔精子发生过程中 。

固醇调节元件结合蛋白-1在小鼠肾脏的表达定位

胆固醇和脂肪酸是细胞膜重要组成成分，也是众多信号分子的前体，广泛参与了机体的生理及病生理调节。

人1型酪蛋白激酶的真核表达及其在肿瘤细胞中的定位

目的:构建带FLAG标签的人1型酪蛋白激酶(CK1)基因的真核表达载体,获得其表达产物,并研究该激酶在骨肉瘤U2OS、乳腺癌ZR-75-1、肝癌HepG2等多种肿瘤细胞中的表达及定位情况。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增人CK1基因的全长编码区,将其克隆到带FLAG标签的pCMV-Tag2B载体中;将重组质粒转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达情况;细胞免疫荧光观察FLAG-CK1质粒在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞中的细胞定位。结果:双酶切和测序结果显示FLAG-CK1真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果表明,FLAG-CK1转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞后成功表达;细胞免疫荧光实验显示,CK1在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞的胞核和胞质中均有分布,且胞核信号强于胞质。结论:构建了CK1的真核表达载体,且FLAG-CK1能在不同肿瘤细胞系的细胞核和细胞质中表达,为进一步研究CK1对细胞的调控奠定了实验基础。

β转化生长因子诱导骨生成时局部IL-1α基因表达与定位

目的:观察β转化生长因子(TGF-β)启动骨膜下新生骨生成局部白细胞介素-lα(IL-lα)的基因表达与细胞定位.方法:在小鼠股骨骨膜下注射TGF-β,诱导软骨及骨的生成过程,应用原位杂交技术检测骨生成局部IL-lα在成骨过程各阶段的基因表达与细胞定位.结果:4d时,IL lα主要定位于骨膜下增生的间充质细胞和纤维母细胞,7d时,主要由幼稚的新生软骨细胞表达,14d及21d时,原始骨小梁周边的成骨细胞表达IL-lαmRNA.长骨部分骨髓细胞在各期有恒定的表达.结论:在TGF-β诱导的骨生成过程中多种细胞分别在不同阶段表达IL-lαmRNA.

SYAP1真核表达载体的构建及蛋白表达定位

目的:构建pcDNA3.1(-)-Myc-突触相关蛋白1(SYAP1)真核表达载体。方法:合成SYAP1基因序列,加入Myc标签序列、EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,并与线性化pcDNA3.1(-)连接,得重组质粒pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1。重组质粒经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确后,脂质体转染HEK293细胞,采用Western blot和间接免疫荧光法检测转染细胞中SYAP1蛋白的表达及定位情况。结果:Myc-SYAP1成功插入pcDNA3.1(-)载体,SYAP1蛋白成功表达且定位于胞浆。结论:pcDNA3.1(-)-Myc-SYAP1载体构建成功。

小鼠IL-1Ra蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

以小鼠脾脏cDNA为模板,用降落PCR扩增IL-1Ra基因片段,IL-1Ra基因片段长约为537 bp。将IL-1Ra扩增片段和原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒,在37℃诱导表达,重组表达的小鼠IL-1Ra蛋白的分子质量为19 ku。用纯度较好的小鼠IL-1Ra重组蛋白免疫兔子,制备特异性多克隆抗体;测定多克隆抗体的效价达到1∶4096000。经Western-Blot鉴定该抗体可与Raw264.7细胞中表达的小鼠IL-1Ra天然蛋白发生特异性结合。利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测表明布鲁氏菌S2弱毒株感染Raw264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞)后小鼠IL-1Ra上调表达。本研究成功制备了小鼠IL-1Ra重组蛋白和兔抗多克隆抗体,为深入探讨小鼠IL-1Ra与布鲁氏菌感染之间的关系提供工具。

灰葡萄孢Bctre1的基因组定位、蛋白质结构预测及表达分析

本研究选取灰葡萄孢菌株BC05.10为试材,克隆Bctre1基因的核苷酸序列并对其进行生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR法研究该基因在不同侵染时期、分生孢子萌发过程中以及不同碳源、海藻糖诱导下的表达情况。结果表明:该基因ID号为5428296,全长3341bp,位于scaffold_17负链的495880~499211位置,与核盘菌Sstre1的同源关系较近;BcTRE1蛋白由1033个氨基酸残基编码组成,该蛋白N端具有2个6发卡结构的超糖苷酶家族和1个C端糖基水解酶家族63。荧光定量PCR结果显示,随着侵染时间的延长Bctre1表达量显著增加(P<0.05),48h后表达量增加不显著;Bctre1在分生孢子萌发24h时表达量最高;Bctre1在海藻糖为单一碳源的培养基中表达量最高,在海藻糖诱导下12h后Bctre1表达量显著增加(P<0.05)。综上,Bctre1与侵染寄主过程中分生孢子萌发及不同碳源利用密切相关,在侵染后期对促进菌丝生长发挥重要作用。

Hp相关胃病病理演变及不同证候IL-1β蛋白差异表达特征

目的通过对白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达的定性定位分析,探索幽门螺杆菌相关胃病(HpGD)病理演变及不同证候的蛋白差异表达特征。方法收集548例HpGD受试者临床四诊资料,其中92例为常规体检受试者,456例为慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡或胃癌患者。所有受试者辨证分为无症状者、脾胃湿热、肝胃不和、脾气虚、瘀血内阻证5组。所有受试者在胃窦或胃黏膜病变处钳取标本,采用快速尿素酶和美蓝染色法检测Hp感染情况;HE染色观察胃黏膜病理组织学改变,分为相对正常、炎症、萎缩、癌前病变、重度异型增生、胃癌6组;Elivision plus标记法检测IL-1β蛋白并观察胃黏膜上皮表层、胃小凹、固有层腺体区的表达差异。结果与炎症组比较,Hp阴性者中IL-1β蛋白在胃癌及癌前病变组表达增高(P<0.05);与相对正常及炎症组比较,Hp阳性者IL-1β蛋白在癌前病变、重度异型增生及胃癌组表达增高(P<0.05),且重度异型增生组表达高于萎缩及癌前病变组(P<0.01)。不同证候间可见Hp阳性者中脾胃湿热证表达强度最高的趋势。胃黏膜上皮表层、胃小凹和固有层腺体区的IL-1β蛋白表达主要定位在胞浆,胞膜、胞核也见少量表达。随着胃黏膜从上皮表层、胃小凹到固有层腺体区,以及病理表现异型增生、肠化、癌变阶段,IL-1β蛋白胞浆表达强度不断增强(P<0.05)。结论IL-1β可能主要通过胞浆表达及Hp感染协同参与HpGD病理演变,且Hp感染、脾胃湿热证与IL-1β高表达或可为HpGD胃黏膜恶性病理演变提供早期预警信号。