IL-10_(23-57)-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b(+)和pet28a(+)构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b(+)的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a(+)的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.

IL-10_(23-57)-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。

IL-10_(23-57)-PE40免疫毒素的实验研究

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL-10第23号至第57号氨基酸)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素A除去受体结合区后的剩余部分)融合构建了IL-1023-57-PE40免疫毒素,对纯化的IL-1023-57-PE40进行了细胞毒活性测定、细胞ELISA、荧光标记和动物模型实体瘤组织切片实验,结果表明:构建的IL-1023-57-PE40符合免疫毒素的作用机制。实验改变了传统免疫毒素机制分析的方法,为免疫毒素的毒性机制分析做了一定有益的探索。

IL-10_(18-57)-PE40高效表达、纯化及细胞活性之研究

以IL-10的功能短肽(40肽,即IL-10第18号至57号氨基酸)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别构建了IL-101857PE40的胞质和胞周质表达质粒,其中,IL101857PE40在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达,在BL21(DE3)pLysS中以胞周质分泌形式表达;表达宿主菌Rosettablue(DE3)超声波破碎后,依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、铜离子亲和层析、阴离子交换层析纯化后,得96%重组毒素纯品;细胞活性实验、细胞ELISA和荧光标记实验表明,构建的IL101857PE40符合免疫毒素的作用机理。因此,该实验为PE免疫毒素的规模制备和纯化做了一定的有益的探索。

重组人IL-6D24-PE40外毒素融合蛋白的构建及其生物学效应

目的 构建重组人白细胞介素 6 绿脓杆菌外毒素融合蛋白IL 6D2 4 PE40 ,以选择性杀伤高表达IL 6受体 (IL 6R)的肿瘤细胞和白血病细胞。方法 采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的重组人白细胞介素 6 (IL 6D2 4)cDNA与缺失细胞结合区的绿脓杆菌外毒素PE40基因进行融合 ,构建IL 6D2 4 PE40融合基因。利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统 ,实现了IL 6D2 4 PE40融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱进行层析纯化 ,采用MTS法检测细胞毒活性。结果 IL 6D2 4 PE40融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 40 %～ 6 0 %。包涵体蛋白经分离、复性及纯化得到纯度 >95 %的融合蛋白。Westernblot证明 ,纯化的融合蛋白与IL 6抗体及PEA抗体均发生特异性结合。细胞毒活性检测证实 ,IL 6D2 4 PE40融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL 6R的U937细胞 ,ID50 约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL 6R的CEM细胞无杀伤作用。结论 IL 6D2 4 PE40融合蛋白能够选择性杀伤高表达IL 6R的靶细胞 ,有希望成为导向治疗高表达IL 6 /IL