松江鲈IL-15 Rα的结构特征与表达分析

白介素15受体α链(IL-15 Rα)是介导IL-15信号转导的高亲和力膜受体复合物的重要亚基。通过RACE技术克隆得到松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel IL-15 Rα)基因cDNA全长序列(命名为TfIL-15Rα),TfIL-15Rα全长为998 bp,包括5′-非编码区(5′-UTR)85 bp,开放阅读框(ORF)663 bp和3′UTR 250 bp。基因ORF编码220个氨基酸(aa),前27 aa为信号肽序列。同源比对发现,松江鲈TfIL-15Rα与其他鱼类的序列一致性为19%~46%,保守度较低。多序列比对结果显示,IL-15Rα保守序列主要分布于sushi结构域(31~95 aa),4个高度保守的半胱氨酸形成的两对二硫键,是结构域发挥配体结合功能的重要位点。qRT-PCR分析表明,TfIL-15Rα广泛表达于松江鲈各组织中。腹腔注射LPS后,在皮肤、血液和肝脏中,刺激后2 h,IL-15Rα表达量迅速上调至最高峰,分别为对照组的14倍、52倍和21倍;而在脾脏中,刺激后12 h,TfIL-15RαmRNA达到最大表达量。由以上实验结果推测,TfIL-15Rα参与到了松江鲈抵抗外界刺激的先天免疫过程中。

可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:对鼠白细胞介素15受体α亚单位(IL-15Rα)的胞外区段,即可溶性IL-15Rα(sIL-15Rα)进行原核表达及纯化,并测定其配体结合能力及相应生物学功能。方法:采用RT-PCR方法,以鼠脾脏细胞总RNA为模板扩增编码sIL-15Rα的基因片段,经测序确证后与原核表达载体pQE-30连接,所得重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα转化E.coli M15构建表达重组子。通过降低诱导温度和IPTG浓度的方式实现重组蛋白的可溶性表达,金属镍螯合的Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,并经SDS-PAGE和Western blot验证。采用固相受体结合分析法测定重组蛋白与IL-15间的亲和力,并以CTLL-2细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性。结果:成功构建了重组表达质粒pQE-30/sIL-15Rα,并在25℃、0.5mmol/LIPTG条件下实现了重组蛋白的可溶性表达。所得重组蛋白的相对分子量约为29 kD,纯度大于95%,与IL-15之间的亲和力为4.9×10-11mol/L,具有显著的协同IL-15促CTLL-2细胞增殖效应。结论:获得了功能性的重组蛋白sIL-15Rα,为深入系统地研究IL-15Rα的独特生物学性状,以及开展IL-15靶向性的研究工作奠定了基础。

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，采用RT—PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基（ChIL-2Rα）编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a（＋）中，获得重组质粒pET32a—exChIL-2Rα，转化宿主菌E．coli Rosseta^TM（DE3）后，经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34ku。序列分析发现，鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为99．5％。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29．6％～54．5％和18．8％～28．0％。表明，禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。