牛膝多糖体外诱导人T细胞表达IFN-γ和IL-4蛋白的机制探讨

目的 :探讨牛膝多糖免疫调节作用的机制。方法 :使用牛膝多糖在不同浓度或在不同时间内对人T细胞进行体外诱导培养 ,用ELISA方法测定培养上清液的IFN γ及IL 4的蛋白表达情况。结果 :①人T细胞受不同浓度ABPS刺激时 ,IFN γ分泌水平随ABPS浓度递增 ,在 4 0 0 μg ml时 ,IFN γ表达量最高 (P <0 0 5 ) ,而IL 4的分泌始终处于低水平 (P >0 0 5 )。②人T细胞在ABPS刺激不同时间后 ,IFN γ分泌水平逐步增高 ,在 4 8小时时与其他各时间点比较 ,有非常显著的差异 (P <0 0 0 1) ,而IL 4的分泌始终处于低水平 (P >0 0 5 )。结论 :①ABPS能诱导人T细胞分泌IFN γ ,该作用呈时间、剂量依赖性变化 ,而抑制IL 4的分泌。②在蛋白表达水平上证实ABPS能够促进Th1类细胞因子的分泌 ,而抑制Th2类细胞因子的分泌。

人IL35-IgG4(Fc)融合蛋白在CHO／DG44细胞中的稳定表达

本研究利用基因重组技术构建人IL35-IgG4(Fc)融合基因真核表达载体,稳定转染CHO/DG44细胞并检测重组蛋白的表达。主要采用聚合酶链式反应(PCR)从脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导的人髓性白血病细胞株KG-IcDNA文库中克隆EBI3和IL-12p35cDNA,重叠PCR法连接2个片段,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVECTM-TOPO载体上,对新构建的IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO真核表达载体并进行酶切、测序、PCR鉴定;脂质体法转染CHO/DG44细胞;RT-PCR检测转染结果,采用a-MEM-培养基筛选实验组细胞,对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤(Methotrexate,MTX)的加压筛选,ProteinG-Agarose纯化阳性克隆培养上清,免疫印迹检测目的蛋白表达。结果显示IL-35-IgG4(Fc)pOptiVECTM-TOPO表达载体稳定转染CHO/DG44细胞并获得阳性克隆;SDS-PAGE电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带;该蛋白能与羊抗人IgG4抗体特异结合。本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的IL35-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞株。

IL-4Rα胞外段的真核表达及鼠源单克隆抗体的制备与鉴定

目的表达IL-4Rα胞外段蛋白(IL-4 receptor α extracellular domain, IL-4Rα ECD),并制备对IL-4及IL-13与IL-4R结合具有阻断能力的抗IL-4Rα鼠源单克隆抗体(单抗)。方法构建含IL-4Rα ECD DNA序列的真核表达质粒,转染Expi293F细胞,对上清中的IL-4Rα ECD进行纯化。采用SDS-PAGE及Western blot对该蛋白进行纯度分析及鉴别;将其免疫小鼠后,筛选相应的鼠源单抗;分别采用SDS-PAGE、Western blot、ELISA、流式细胞法及细胞抑制法对单抗的纯度、特异性、结合活性、阻断活性进行鉴定。结果酶切及测序结果表明,IL-4Rα ECD重组表达质粒构建正确;蛋白成功表达,相对分子质量为43 000~48 000,纯度在95%以上;免疫后小鼠血清效价在107以上;制备的1株鼠源单抗6-G2与IL-4Rα的ELISA半最大效应质量浓度(concentration for 50%of maximal effect, EC50)为10.4 ng/mL;竞争ELISA检测结果显示,6-G2单抗对IL-4与IL-4Rα结合的最大抑制率为27.3%;流式细胞法检测结果显示,6-G2单抗能阻断IL-13与相应受体的结合;细胞增殖抑制法检测结果显示,6-G2单抗几乎能完全抑制细胞的增殖。结论成功表达并纯化了IL-4Rα ECD,制备的抗IL-4Rα鼠源单抗6-G2单抗能同时阻断IL-4及IL-13与IL-4R的结合,为后续开发针对抗IL-4Rα的治疗性抗体药物奠定了基础。