猪IL-6 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用 RT- PCR方法 ,从经刀豆球蛋白 A(Con A)诱导的猪外周血单核细胞 (PMBCs)总 RNA中扩增得到了猪 IL -6 (porcine IL- 6 ,p IL- 6 )的 c DNA,并将其克隆到 p GEM- T载体上。DNA序列测定表明 ,克隆得到的 p IL- 6 c DNA与国外报道的完全一致 ,包括终止密码子在内其编码区的长度为 6 39bp,编码 2 12个氨基酸残基的蛋白质。将 p IL - 6成熟肽段编码区亚克隆至 p ET- 2 8(a)中 ,构建成原核表达质粒 p ETPIL6。该质粒的 BL2 1(DE3) L ys S转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达 p IL- 6 ,表达量占菌体总蛋白的 30 .6 0 %～ 38.35 %。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

人类IL-3受体α亚单位与小鼠AIC2B蛋白的相互作用

目的 探索人类IL - 3受体 (IL - 3R)α亚单位与小鼠内源性AIC2B蛋白在诱导细胞增殖信号表达过程中的相互作用。方法 通过PCR扩增技术 ,构建了IL - 3Rα亚单位胞浆域缺失突变子 34、2 2和CD ,然后将野生型和突变型IL - 3Rα亚单位cDNA分别转染到含小鼠IL - 3R基因表达的BaF3细胞 ,并检测了阳性转染子的增殖信号传导和酪氨酸磷酸化。结果 表达野生型hIL - 3Rα/ βc的BaF3阳性对照克隆在生理浓度hIL - 3诱导后即可出现细胞增殖和胞浆信号蛋白 βc、Jak2及Shc磷酸化 ;而含野生型IL - 3Rα亚单位和AIC2B的BaF3细胞可出现高浓度hIL - 3刺激的细胞增殖反应 ,但无信号传导分子的活化 ;共表达突变型IL - 3Rα与AIC2B的BaF3细胞及未转染的BaF3细胞则对各种浓度的hIL - 3刺激均无反应。结论 尽管hIL - 3Rβc亚单位在hIL - 3诱导的信号传导过程中担负关键作用 ,但小鼠内源性AIC2B也可与hIL - 3Rα重建功能性hIL - 3R ,这种功能的表达需要hIL -

他克莫司对人Jurkat淋巴瘤细胞分泌IL-6和sIL-2R及表达IL-6和sIL-2RmRNA的影响

目的探讨他克莫司对淋巴细胞分泌IL-6和sIL-2R及表达1L-6和sIL-2RmRNA的影响。方法酶联免疫吸附试验测定不同浓度他克莫司对人Jurkat淋巴瘤细胞产生IL-6和sIL-2R的影响，实时荧光定量PCR法分析他克莫司对淋巴瘤细胞IL-6mRNA和sIL-2RmRNA表达的影响。结果102-10nmol／L他克莫司可以抑制Jurkat淋巴瘤细胞分泌IL-6、sIL-2R（P值均〈0．05），其中10^3-10^4 nmol／L他克莫司作用显著。10^2nmol／L他克莫司可下调淋巴瘤细胞IL-6和sIL-2RmRNA的表达（P值均〈0．05）。结论适当浓度他克莫司可抑制淋巴细胞分泌IL-6和sIL-2R，下调IL-6和sIL-2RmRNA的表达。