重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

目的:构建大肠杆菌-毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功。结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础。

IL3-PE38KDEL融合基因的构建及原核表达

目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达。方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL。重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确,转化感受态大肠杆菌SG13009,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分子量大小,Western blot鉴定。结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功,IPTG诱导后得到了与预计分子量相符的目的蛋白。经Western blot鉴定在分子量57kD处有明显特异性条带,说明目的蛋白正确表达。结论:成功构建融合蛋白IL3-PE38KDEL,为后续的蛋白质纯化及功能研究奠定基础。

IL-3-PE38KDEL转染CIK细胞对HL60细胞体内外杀伤作用的实验研究

目的研究IL-3-PE38KDEL基因转染细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对HL60白血病细胞的杀伤作用。方法应用脂质体将融合基因IL-3-PE38KDEL转染CIK细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)法检测转基因前后CIK分泌细胞因子能力及细胞表型的变化,MTS法检测基因转染CIK细胞对HL60细胞细胞毒活性的变化,建立HL60裸鼠模型,给予IL-3-PE38KDEL转染CIK细胞、空质粒转染CIK细胞、未转染CIK细胞及生理盐水,观察其对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结果通过脂质体成功将IL-3-PE38KDEL转染CIK细胞,转染前后CIK细胞的分泌细胞因子能力及细胞表型无明显变化,转染后CIK细胞对HL60细胞的杀伤活性较空质粒转染CIK细胞及未转染CIK细胞明显提高,体内实验表明基因转染CIK细胞可明显抑制裸鼠皮下HL60细胞移植瘤的生长。结论 IL-3-PE38KDEL基因转染CIK细胞能够明显抑制体内外HL60细胞的生长,同时不影响CIK分泌细胞因子能力及细胞表型。

pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒对人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的靶向抑制

目的:验证SERPINB3鳞癌特异性启动子调控下的PE38KDEL毒素表达质粒对人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的靶向抑制作用。方法:通过构建人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型,经过质粒体内转染,对小鼠进行体重、肿瘤体积变化的测量以及HE、TUNEL、Ki-67免疫组化检测。结果:在不损伤正常组织的情况下,pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒对舌鳞癌具有靶向抑制作用。结论:通过SERPINB3鳞癌特异性启动子调控下的PE38KDEL毒素表达质粒对人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的具有靶向治疗的可能性,为建立肿瘤特异性基因调控自杀基因成为靶向毒素体系提供了实验依据。

重组融合蛋白IL-3-PE38KDEL对急性髓性白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的观察重组融合蛋白IL-3-PE38KDEL对急性髓性白血病(Acute myelocytic leukemia,AML)细胞HL-60(IL-3R阳性)和NB4(IL-3R阴性)增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度的IL-3-PE38KDEL分别作用HL-60和NB4细胞,MTT法检测细胞的增殖抑制作用,计算抑制率及半数抑制浓度(IC50)。将HL-60和NB4细胞分别分为IL-3-PE38KDEL组和IL-3+IL-3-PE38KDEL组,IL-3+IL-3-PE38KDEL组加入IL-3(100 ng/ml),孵育4 h后,IL-3-PE38KDEL组和IL-3+IL-3-PE38KDEL组均加入IC50浓度的IL-3-PE38KDEL,计算细胞增殖抑制率;流式细胞术检测2种AML细胞细胞周期的变化及凋亡情况。结果 IL-3-PE38KDEL对HL-60和NB4细胞的增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性,对HL-60细胞的抑制作用强于NB4细胞(P<0.05),IC50值分别为2.5μg/ml和259.2μg/ml。当IL-3-PE38KDEL浓度为IC50时,经IL-3处理后,对HL-60和NB4细胞增殖的抑制率均值分别为32.20%和49.00%。经IL-3-PE38KDEL作用后的HL-60细胞大部分被阻滞于G1/S期。HL-60细胞IL-3-PE38KDEL组的细胞凋亡率均值(19.71%)显著高于IL-3+IL-3-PE38KDEL组(9.39%)(P<0.05),NB4细胞两组差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论 IL-3-PE38KDEL能抑制IL-3R阳性的AML细胞HL-60增殖,并诱导其凋亡,但对IL-3R阴性的AML细胞NB4的抑制作用较弱。

高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定

旨在利用简单的表达纯化工艺,获得纯度较高、有活性的重组免疫毒素IL3-PE38KDEL并对其物理学及免疫学性质进行鉴定。利用PQE30-IL3-PE38KDEL/SG12009工程菌表达重组免疫毒素IL3-PE38KDEL,在提取包涵体后经一步强阳离子柱层析得到纯度较高的免疫毒素复性纯化产物,用Westenblotting、质谱、氨基测序等先进技术对产物鉴定。结果显示,发酵后目的蛋白表达量占总菌体的17.56%,经强阳离子柱层析纯化复性后的目的蛋白纯度达到90%以上,Western blotting、质谱、氨基测序结果均表明,纯化产物分子量为54.9kD且具有相应的免疫学活性,序列与预期序列完全一致。纯化复性方法对重组免疫毒素IL3-PE38KDEL的生物性质及纯度有较大影响,因此选择一种适当的纯化复性方法至关重要。