骨唾液酸蛋白通过整合素α_vβ_3调控ILK信号通路

旨在探究骨唾液酸蛋白(BSP)是否通过整合素αvβ3对整合素连接激酶(ILK)信号通路进行调控。BSP基因沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞,流式细胞仪在细胞水平检测BSP不同水平的细胞株中整合素αvβ3的表达量。Western blotting检测磷酸化ILK水平的变化,MTT法检测细胞增殖能力。与对照组231BO-Scrambled细胞相比,BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞中整合素αvβ3的表达水平明显下调(61.32±1.94)%(P<0.01)。整合素αvβ3鼠抗单克隆抗体(LM609)处理前的BSP基因沉默组231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(39.38±1.38)%(P<0.01);LM609处理后的231BO-BSP27细胞与21BO-Scrambled细胞相比,ILK磷酸化水平下调明显(33.78±1.51)%(P<0.01)。向乳腺癌细胞231BO-scrambled和231BO-BSP27中添加LM609,MTT试验结果显示两株乳腺癌细胞的增殖能力均有降低(P<0.05)。BSP通过整合素αvβ3对乳腺癌MDA-MB-231细胞ILK信号通路进行调控,并影响细胞增殖。

基于ILK信号通路探究马桑水提取物影响大鼠烧伤创面愈合和瘢痕增生的机制

目的:基于整合素连接激酶(ILK)调控的转化生长因子β1(TGF-β1)和PI3K/AKT调控的ILK等互通信号通路,探究马桑水提取物(CSME)促进大鼠烧伤创面早期愈合和抑制后期瘢痕过度增生的机制。方法:随机将180只SD雌性大鼠(180~200 g)分成正常对照(NC)组、凡士林(VL)组、磺胺嘧啶银(SS)组及CSME低、中和高剂量(CSME-L、CSME-M和CSME-H)组,每组各30只。大鼠以水合氯醛麻醉,腰背部II°烫伤造模后,每天分别在创面涂擦VL、SS和3种剂量的CSME烧伤软膏,计算创面愈合率(HR),于第7、14和21天随机选取各组动物10只,水合氯醛麻醉,切取创面皮肤,病理学观查,Western blot检测相关蛋白表达,RT-qPCR检测相关mRNA表达,培养成纤维细胞检测其胶原收缩率(SK)。结果:在第7天,CSME各组创面中ILK、纤维连接蛋白(FN)、TGF-β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和整合素β1(integrin-β1,ITG-β1)的蛋白与mRNA表达呈现剂量依赖性强于VL和SS组,第21天,弱于VL和SS组(P<0.05);第14天,CSME各组组织中I型胶原蛋白(Col I)的蛋白与mRNA表达呈剂量依赖性强于VL和SS组,第21天则弱于VL和SS组(P<0.05),而III型胶原蛋白(Col III)的蛋白与mRNA表达呈剂量依赖性弱于VL和SS组,第21天则强于VL和SS组(P<0.05);随时间推移,VL和SS组成纤维细胞的SK持续升高,96 h达高峰,而CSME各组在24 h和48 h呈剂量依赖性高于VL和SS组,在96 h呈剂量依赖性低于VL和SS组(P<0.05)。结论:CSME早期促进烧伤创面愈合,后期抑制创面瘢痕过度增生,其机制与其多成分多靶点影响ILK调控的TGF-β1和PI3K/AKT调控的ILK信号通路及ColⅠ与Col III表达比的调控相关。

过表达核糖核酸酶抑制因子通过调节ILK/PI3K/AKT信号途径抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞体内外生长

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是胞浆内的一种酸性蛋白质.已有研究证明,RI与核糖核酸酶A(RNase A)和血管生成素(angiogenin,ANG)结合可抑制其活性.本室前期实验证实,RI可有效抑制某些肿瘤的生长和转移.然而,RI抑制肿瘤的分子机制尚不清楚.本研究探讨RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞生长和凋亡的影响及其机制.MTT法结合流式细胞术分析结果证明,RI基因稳定转染导致B16-F10黑色素瘤细胞S期阻滞,抑制B16-F10黑色素瘤细胞增殖.Annexin V/PI结合流式细胞术结果显示,RI过表达引起细胞凋亡.与此相一致,蛋白质印迹分析显示,过表达RI引起抗凋亡分子Bcl-2表达下调,而Bax上调,同时伴有Pro-casepase 3激活.C57BL/6小鼠移植成瘤实验显示,与对照相比,转染RI的B16-F10细胞形成的肿瘤重量显著减少,同时伴有肿瘤组织微血管密度降低.提示RI过表达能抑制微血管生成.此外,体内外组织/细胞免疫化学和蛋白质印迹结果揭示,过表达RI可显著抑制整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)下游靶分子Akt和GSK-3β的磷酸化,并降低β-联蛋白的表达.研究结果证明,过表达RI可通过抑制ILK/PI3K/AKT信号通路,促进细胞凋亡,引起S期阻滞,并抑制血管生成,从而显著抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞在体内、外的生长.上述结果提示,RI可能是治疗黑色素瘤的有效分子靶点.

上调核糖核酸酶抑制因子对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响

目的研究核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因表达对小鼠黑色素瘤B16细胞生长和凋亡的影响。方法构建RI真核表达质粒p IRES2-EGFP-RI稳定转染B16细胞,未转染和空质粒作对照组(p IRES2-EGFP组),经G418筛选出阳性克隆。RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测RI的表达;MTT检测细胞的增殖;流式细胞术、TUNEL及Hochest33342检测细胞周期及凋亡;Western blot检测凋亡相关的蛋白及ILK/PI3K/AKT信号通路关键分子的表达;分别注射各组B16细胞到C57/BL小鼠建立移植瘤模型,观察肿瘤的生长及肿瘤微血管的变化,进一步分析ILK/PI3K/AKT信号通路蛋白在肿瘤组织中的表达。结果转染RI细胞组的RI mRNA和蛋白表达水平显著升高;MTT结果显示B16-RI细胞较对照组增殖能力明显降低,流式细胞结果显示B16-RI细胞的S期明显增加,表明RI表达上调后细胞生长停滞于S期(P<0.05);Hochest 33342、TUNEL及Annexin V和PI双染色流式法细胞凋亡检测结果证实,B16-RI细胞与对照组相比出现大量凋亡细胞(P<0.01)及典型凋亡形态特征:染色质凝集,核碎裂和明亮的蓝色荧光等;Western blot结果显示,与对照组相比,B16-RI细胞中ILK、p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2及β-catenin的表达明显降低,而活化的Caspase-3和Bax蛋白的表达显著增加(P<0.01);动物的移植瘤实验结果显示,转RI组的小鼠的瘤重显著降低(P<0.01),瘤组织中的血管密度明显减少,同时ILK、p-Akt、p-GSK3β、β-catenin在瘤组织中表达减少。TUNEL肿瘤组织凋亡检测结果与体外细胞一致。结论过表达RI可能通过调节ILK/PI3K/AKT信号通路显著抑制了小鼠黑色素瘤B16细胞的生长并诱导了B16细胞的凋亡。

siRNA沉默胸腺素β_4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响

目的利用siRNA干扰技术研究胸腺素β_4(Tβ_4)基因沉默对鹿茸间充质干细胞(MSC)增殖的影响。方法鹿茸MCS分为阴性对照组、siRNA-Tβ_4转染组2组。MTT检测MSC增殖的变化,Real-time PCR检测ILK、AKT及Cyclin D1 mRNA表达量差异变化,Western blot检测AKT及P-AKT蛋白含量变化。结果 siRNA-Tβ_4转染组MSC增殖受到显著抑制(P<0.01);siRNA-Tβ_4转染组ILK、Cyclin D1 mRNA表达量下调,AKT mRNA表达量不变;siRNA-Tβ_4转染组总AKT蛋白含量无变化,P-AKT蛋白含量减少。结论 Tβ_4基因沉默能显著抑制MSC增殖,并可能通过下调ILK、P-AKT及细胞周期相关蛋白CyclinD1从而抑制MSC细胞增殖。