耐亚胺培南细菌金属β-内酰胺酶IMP基因的检测

目的 :探讨并建立金属 β 内酰胺酶IMP基因的PCR方法。 方法 :临床分离的病原菌用全自动微生物分析系统鉴定 ,纸片扩散法进行抗生素敏感试验 ,采用 2 巯基丙酸络合金属离子的纸片扩散法来检测金属酶表型 ,PCR法检测金属酶IMP基因。结果 :2 7株耐亚胺培南细菌金属酶表型共检出产金属酶菌株 8株 ,其中铜绿假单胞菌 7株、嗜麦芽窄食单胞菌 1株 ;7株表型产金属酶铜绿假单胞菌IMP基因扩增阳性 ,其他扩增均阴性。结论 :该方法是一种灵敏度高。

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因在大肠杆菌中表达条件优化

[目的]为提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coli BL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和Gene Tools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH 7.0,装液量20%,振荡速度200 r/min;最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6 h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达70.98 mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。

莴苣丛枝植原体免疫膜蛋白(Imp)的抗原表位预测及Imp基因原核表达

采用PCR方法,从采自云南元谋地区的莴苣丛枝植株总DNA中扩增到植原体免疫膜蛋白Imp基因,并进行抗原表位分析和原核表达.结果表明,莴苣丛枝植原体免疫膜蛋白Imp基因长519 bp,编码一个包括172个氨基酸的蛋白.蛋白分子量为19 ku,理论等电点为8.61,在N-末端有一个明显的跨膜区,不存在信号肽切割位点.抗原表位分析认为,该蛋白氨基酸的第62～ 83,95～113,133～145区段为该蛋白最可能的蛋白表位区.通过构建原核表达载体pET30a-lmp,转入宿主菌BL21（DE3）-plysS中,经IPTG诱导表达出约25 ku的融合蛋白.

IMP3基因在葡萄胎中的表达及其意义

目的:探讨IMP3基因在葡萄胎中的表达及其意义。方法:应用免疫组织化学链霉亲和素-过氧化物酶(SP)法检测IMP3基因在不同转归患者初次清宫葡萄胎组织中的表达。结果:IMP3基因在人绒毛膜促性腺激素(HCG)>2×10~5 mIU/ml患者和HCG<2×10~5 mIU/ml患者中均有表达;IMP3基因在HCG>2×10~5 mIU/ml葡萄胎患者中阳性表达率为90%,在HCG<2×10~5 mIU/ml患者中的表达率为78%,两者比较差异有统计学意义(x^2=2.245,P<0.05)。在HCG>2×105m IU/ml的葡萄胎患者中,后来发展为侵蚀性葡萄胎患者的IMP3基因表达阳性率高,组间比较差异有统计学意义(x^2=10.719,P<0.05);HCG<2×10~5 mIU/ml葡萄胎患者中,后来发展为侵蚀性葡萄胎患者的IMP3基因表达阳性率高,组间比较差异有统计学意义(x^2=14.438,P<0.05)。结论:IMP3基因作为一种特异性很高的胞浆标志物,表达于葡萄胎合体滋养细胞,在HCG>2×10~5 mIU/ml的葡萄胎组织中表达率高。IMP3基因与葡萄胎的转归密切相关,有望成为判断葡萄胎的发生、发展及转归的标志物。

牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列分析

[目的]为了解牛源犬新孢子虫IMP1基因生物学特性,分析牛源犬新孢子虫IMP1基因的克隆与序列。[方法]应用PCR技术扩增IMP1基因,将纯化的PCR产物和pMD18-T Simple Vector连接,构建pMD18-IMP1重组克隆质粒,进行PCR鉴定和酶切鉴定,将鉴定为阳性的质粒进行测序分析。[结果]PCR扩增犬新孢子虫IMP1基因大小为762 bp,克隆质粒经测序分析与GenBank(XM_003879531.1)中IMP1基因的同源性为99.9%。[结论]该试验为犬新孢子虫IMP1基因的表达及后续研究奠定了基础。

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.

苹果树腐烂病菌分隔蛋白基因VmImp2的功能研究

旨在研究苹果树腐烂病菌(Valsa mali)VmImp2基因的功能,以期揭示腐烂病菌的生长发育及致病机理。利用生物信息学软件对VmImp2进行蛋白序列及进化分析;利用Double-joint PCR和PEG介导原生质转化的方法,获得腐烂病菌VmImp2的缺失突变体和回补菌株;利用十字交叉法以及伤口接种法,研究VmImp2对病菌营养生长,繁殖体产生以及致病力的影响。生物信息学分析显示,VmImp2编码1487个氨基酸,编码蛋白属于PCH(Pombe Cdc15 homology)家族,含有典型的FCH(Fes/CIP homology,F-BAR)和SH3(Src Homology 3)结构域,与梨树腐烂病菌(V.pyri)的Imp2蛋白亲缘最近。对基因进行敲除后,共获得5个缺失突变体菌株。表型分析显示,缺失突变体的营养生长受到明显影响,表现为菌丝更加稀疏,生长速率明显减缓。同时,突变体的繁殖体产生能力以及对枝条的侵染能力基本丧失。5个突变体的表型一致。将基因回补之后,共获得3个回补菌株,突变体表型缺陷基本恢复到野生型水平。说明VmImp2基因参与苹果树腐烂病菌的营养生长、繁殖体形成以及致病过程。

Optimization of Expression Conditions for Immunodominant Membrane Protein Gene of Phytoplasmas in E.coli

[Objective] This study aimed to increase the expression level of immun- odominant membrane protein gene （Imp） of phytoplasmas in E. coil BL21 （DE3）. [Method] On the basis of orthogonal experiment, effects of different culture conditions on recombinant bacteria E. coil BL21-pET-28a（＋）-Imp were investigated. Based on the obtained optimal culture condition, effects of different induction conditions on the ex- pression level of Imp protein were explored. The expression level of Imp fusion pro- tein was analyzed by using SDS-PAGE and Gene Tools software. [Result] The re- sults showed that the optimal conditions for culture were at 37℃, pH 7.0, with liq- uid volume of 20% and oscillation speed of 200 r/min, for induction were at 37℃ for 6 h, with initial OD600 of about 1.5 and IPTG final concentration of 0.1 mmol/L. [Conclusion] The expression level of Imp achieved 70.98 mg/L under the optimal conditions. Optimized conditions for expression of Imp fusion protein in E. coil were determined.