克隆IN-1重组单链抗体基因与促进中枢神经再生的研究(英文)

目的利用基因工程技术,对IgMG型的IN-1的基因进行改良,以得到IN-1重组单链抗体(scFv)cDNA基因片段为促使受损的中枢神经再生和治疗弥漫性轴索损伤开辟一个崭新途径。方法宿主菌为大肠杆菌DH5a,克隆质粒为pUC18。参照genebank中发表的IN-1抗体的轻链重链序列,重新设计适于在大肠杆菌中表达的目的基因片段,将该基因双链分成35个小片段合成,经退火、复性连接成目的片段后,克隆到经过BamHI和HindIII双酶切的克隆载体pUC18中,并转化大肠杆菌DH5a,抽提重组子pUC18/744进行克隆PCR、酶切鉴定及测序分析。结果测序结果证明获得的基因序列与实验设计仅差一个碱基。结论正确设计并合成了IN-1重组单链抗体(IN-1-scFv)的cDNA,为深入研究其生物活性奠定了基础,也为应用抗体工程治疗弥漫性轴索损伤开创了一个新思路。

重组白细胞介素4受体(IL-4R)噬菌体单链抗体库构建及筛选

目的应用噬菌体展示技术构建重组白细胞介素4受体（IL-4R）噬菌体单链抗体（sc Fv）库,并从抗体库中进行筛选。方法利用重组人IL-4R（rh IL-4R）蛋白免疫BALB/c小鼠,提取总RNA,反转录PCR扩增V_H和V_L基因,经重叠延伸PCR扩增出带有限制性酶切位点的sc Fv,用限制性内切酶SfiⅠ和NotⅠ分别双酶切sc Fv和p CANTAB5E载体,利用T4连接酶进行连接,转入感受态细菌E.coli TG1中制备转化子;在培养基中培养得到噬菌体单链抗体库;通过3轮富集和筛选,选择抗原亲和力最强的克隆进行测序分析。结果经过3轮筛选,构建了库容为2×10~8的rh IL-4R单链抗体库,测序结果显示抗rh IL-4R蛋白sc Fv基因全长741 bp,编码247个氨基酸。通过VBASE2数据库分析,抗rh IL-4R蛋白的V_H和V_L基因序列都存在3个互补决定区和4个骨架区。结论成功构建了抗rh IL-4R蛋白噬菌体sc Fv库。

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。

重组抗IL-4R单链抗体的表达与检测

为了运用噬菌体展示技术对抗白细胞介素-4受体(IL-4R)特异性单链抗体进行表达与鉴定,试验提取了前期工作中经富集与筛选抗IL-4R单链抗体库而得到的特异性pCANTAB5E-sc Fv重组质粒,用NotⅠ和SfiⅠ双酶切鉴定样本并将质粒送上海英骏生物公司测序;利用pCANTAB-5E噬菌体展示系统(pCANTAB-5E、TG1、M13K07、HB2151)表达抗IL-4R单链抗体重组蛋白;通过SDS-PAGE和Western-blot分析单链抗体的表达情况及抗体的活性。结果表明:pCANTAB-5E噬菌体展示系统表达出的单链抗体重组蛋白分子质量在25~35 ku之间,28 ku左右,与测序结果预测的蛋白分子质量接近。说明成功表达了抗IL-4R单链抗体重组蛋白。

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的 :构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体 (hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素 (hEDN)融合基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :利用RCR的方法扩增hEDN基因 ,克隆入含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plyS后 ,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS -PAGE及Westen -blot分析及鉴定。结果 :成功构建了抗肝癌hdsFv -hEDN融合基因原核表达载体 ;SDS -PAGE和Westen -blot分析显示 ,诱导表达产物出现一条Mr约为 4 5 .0KD的新生蛋白带 ,表达量占菌体总蛋白量的 2 2 % ,主要以包涵体形式存在。结论 :抗肝癌hdsFv -hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达 。

堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建

用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。

重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原导向溶栓剂的基因构建及表达

为了获得特异性高的导向溶栓药物,应用PCR技术,得到抗人活化血小板单抗(SZ-51)的Fab′基因片段。再用酶切方法,将Fab′中CH1基因片段替换成合成的连接分子(linker)基因,构建成单链抗体基因,并插入到人尿激酶原分泌肽基因及低分子量单链尿激酶(scu-PA-32k)之间,最终构建成重组抗人活化血小板单链抗体-尿激酶原融合蛋白基因。此融合蛋白基因在昆虫细胞中得到表达。纯化的表达产物SDS-PAGE鉴定,其分子量约为60kD,与预期值相符。其比活为9000IU/mg蛋白。ELISA法初步证明此重组的融合蛋白具有与活化血小板抗原结合特异性。

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,对其产物作初步鉴定 ,为肝癌的导向治疗奠定基础。方法 :采用分子克隆技术 ,PCR法扩增PE38基因片段 ,克隆入GST -融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ,受IPTG诱导表达后 ,SDS -PAGE及Westernblot分析GST融合蛋白结果。结果 :成功构建免疫毒素表达载体pGEX - 4T - 1-hscFv -PE38(以下简称pGEXh -PE38) ;SDS -PAGE清晰显示Mr为 90 0 0 0的目的蛋白条带 ,光密度薄层扫描提示表达量为 11% ,Westernblot在相同位置显示蛋白印迹 ,证实载体构建及表达均正确。结论 :利用基因重组技术 ,在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv -PE38。

单链重组抗体的表达及其临床应用

利用ＤＮＡ重组技术，在体外构建Ｆｖ和单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）的重组基因，并连入多种类的表达载体，使重组抗体在原核细胞、哺乳类动物细胞、酵母、噬菌体表达系统中获得表达。体外表达高产量、天然活性的Ｆｖ和ｓｃＦｖ蛋白在临床的诊断、治疗等方面均具有广泛的应用。

抗胃癌单链抗体免疫毒素重组质粒的构建及表达

目的 构建能表达抗胃癌单链抗体免疫毒素的重组质粒并进行表达。方法 应用基因工程方法 ,将抗胃癌的单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素基因进行重组 ,得到的重组质粒转化大肠杆菌BL - 2 1,鉴定后的阳性克隆经IPTG诱导表达。结果 重组质粒经酶切鉴定正确 ,IPTG诱导后可看到明显的表达带 ,分子大小与预计值相符。结论 得到了能表达抗胃癌单链抗体免疫毒素的重组质粒。

抗人大肠癌重组单链抗体的研制

应用重组噬菌体抗体系统制备了重组单链抗体。首先从抗人结肠癌ND-1单抗杂交瘤细胞中提取mRNA,利用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增出单抗重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)片段,再通过连接DNA合成单链抗体可变区片段(ScFv),然后经双酶切后克隆到pCANTAB5E载体中,在E.coliTGI细胞中表达出噬菌体融合蛋白,用抗原阳性噬菌体感染E.coliHB2151细胞,产生单链抗体,该单链抗体既保持了原单抗的特异性,应用上又优于原单抗。

变形链球菌重组表面蛋白(rA-P)人源单链抗体的筛选及其活性检测

目的从PDNA5噬菌体抗体库中筛选变形链球菌重组表面蛋白的人源噬菌体单链抗体,将其表达制备非融合单链抗体,并探讨其生物学特性。方法用变形链球菌重组表面蛋白rA-P包被免疫试管,对pDAN5噬菌体抗体库进行5轮亲和免疫筛选制备抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体,并将其感染大肠杆菌HB2151,用IPTG诱导表达非融合性单链抗体,非融合性单链抗体包涵体复性后用Western blot检测其生物活性。结果筛选得到13株抗rA-P蛋白的噬菌体单链抗体;用HB2151表达的非融合性单链抗体分子量为30kD,表达量达菌体蛋白的30%,Western blot检测显示,复性后的非融合性单链抗体能与rA-P蛋白发生特异性抗原抗体反应,证明表达的非融合性单链抗体有生物活性。结论成功地利用噬菌体抗体库技术筛选、表达制备有生物活性的抗变链菌表面蛋白的人源单链抗体。

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的 :重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体 (anti NI 35 scFv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据抗NI 35抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到克隆载体 pUC 18中 ,经全自动序列分析仪测序证实 ,再亚克隆至表达载体 pET 2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,诱导表达。 结果 :合成的基因序列与设计的仅差一个碱基 ,目的基因连接方向及阅读框架正确 ;SDS PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 31kDa的融合蛋白 ,并得到了良好的生物活性。结论 :抗NI 35重组单链抗体基因表达载体的构建和表达 。

IN-1重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

目的 :设计并人工合成IN 1重组单链抗体 (recombinantIN 1single chainantibody)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。方法 :根据 genebank中发表的IN 1抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的基因片段 ,该基因双链分 35个小片段合成 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到克隆载体 pUC 18中 ,经全自动序列分析仪测序证实后 ,再亚克隆至表达载体pET 2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,诱导表达。结果 :测序结果合成的基因序列与设计的仅差一个碱基 ;SDS PAGE检测显示 ,表达出相对分子量 31kd的融合蛋白。结论 :IN 1重组单链抗体基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究其生物活性奠定了基础。

IN-1重组单链抗体基因的克隆和序列分析

目的 应用基因工程技术获得人工设计的IN - 1重组单链抗体 (IN - 1-scFv)的cDNA克隆。方法 参照 genebank中发表的IN - 1抗体的轻链重链序列 ,重新设计适于在大肠杆菌中表达的目的基因片段 ,将该基因双链分成 3 5个小片段合成 ,经退火、复性连接成目的片段后 ,克隆到经过BamHI和HindIII双酶切的克隆载体pUC18中 ,并转化大肠杆菌DH5a,抽提重组子 pUC18/744进行克隆PCR、酶切鉴定及测序分析。结果 测序结果证明获得的基因序列与实验设计仅差一个碱基。结论 正确设计并合成了IN - 1重组单链抗体 (IN - 1-scFv)的cDNA 。

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达

重新设计并人工合成抗NI 35重组单链抗体(anti NI 35 scfv)的cDNA克隆 ,构建其表达载体 ,在原核系统中实现初步表达。认为抗NI 35重组单链抗体 (IN 1 scFv)基因表达载体的构建和表达 ,为深入研究anti NI 35 scFv应用于神经系统损伤和修复奠定了基础。

抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达

目的 筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组 B抗原 (r- Ag B)的人源单链可变区抗体 (Sc Fv) ,为细粒棘球蚴 B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径。 方法 采用噬菌体表面展示技术 ,以重组纯化的细粒棘球蚴 B抗原为固相抗原 ,经过 5轮“吸附 -洗脱 -扩增”的筛选过程 ,从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗 r- Ag B的 Sc Fv基因片段的阳性克隆 ,提取质粒 ,经 Sfi /Not 酶切鉴定后 ,亚克隆到 p CANTAB5 E载体上 ,转化大肠杆菌 XL1 - Blue,经 IPTG诱导 ,表达可溶性 Sc Fv。 结果 筛选得到的 Sc Fv片段基因为 76 8bp,经 SDS- PAGE鉴定 ,在大肠杆菌 XL1 - Blue中表达的 Sc Fv分子质量约 2 8ku,经过 EL ISA和 Western- Blot检测 ,该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性。 结论 细粒棘球蚴重组 B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功 。

应用体外重组PCR技术构建鸡单链抗体基因的研究

用异硫氰酸胍与β_巯基乙醇联合变性的方法 ,从罗曼鸡脾脏中提取总RNA ,RNA样品经紫外检测后 ,A2 3 0=0 .0 715 ,A2 60 =0 .15 18,A2 80 =0 .0 793;根据莱航鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区基因的骨架区 1和骨架区 4的序列 ,分别设计一对引物 ,通过反转录_PCR方法 ,分别扩增出了罗曼鸡的轻、重链可变区基因 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示其大小分别约为 36 0bp和 4 2 0bp ;以VL 和VH 为模板 ,借助重组PCR手段 ,构建了VL_Linker_VH 形式的鸡单链抗体 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示出一条约 780bp区带。为进一步构建鸡的噬菌体抗体库和筛选特异性的鸡单链抗体打下了基础。

病毒表达的重组单链抗体阻断鸡疟原虫子孢子感染埃及伊蚊唾腺

本文通过埃及伊蚊RED株研究新培斯(Sindbis)病毒表达的一类单链抗体(N2scFv)在阻断鸡疟原虫子孢子感染伊蚊唾腺中所起的作用。