石榴蔗糖代谢相关酶SPS和INV基因家族鉴定与表达分析

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖转化酶(INV)是蔗糖代谢的关键调控酶,在植物生长发育过程中起重要作用。本研究利用生物信息学和荧光定量PCR等分子手段,鉴定石榴SPS和INV基因家族成员,分析其理化性质、保守结构域、保守基序、二级结构、亚细胞定位、系统进化关系和表达模式。结果表明,从石榴基因组中鉴定出4个SPS基因和11个INV基因,其编码蛋白均为不稳定蛋白,具有典型的保守结构域,家族成员间特征motif数量和种类大致相同,蛋白结构高度保守;这些蛋白不均匀地分布在染色体上,均定位于叶绿体中,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。石榴SPS和INV基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系,与巨桉同源性较高;不同SPS和INV基因在石榴果实不同发育时期的表达模式存在差异,PgINV3在9月15日(果实增大期)表达水平最高,显著高于其他时期。本研究结果对解析石榴果实中蔗糖代谢的分子机理具有重要意义。

鼠疫耶尔森氏菌inv基因中IS1541的研究及应用

目的 了解鼠疫耶尔森氏菌 inv基因中 IS15 41的插入情况 ,为鼠疫耶尔森氏菌的鉴别诊断提供依据。方法 PCR反应及 Southern杂交分析。结果 对来自不同疫源地的 5 0株鼠疫耶尔森氏菌的 inv基因中部分序列进行扩增 ,均可扩出一条长为 10 0 0 bp的片段 ,用 IS15 41作探针 ,对其进行 Southern杂交分析 ,杂交结果无差别 ,而对照菌株除假结核耶尔森氏菌扩出一条长约 30 0 bp左右的片段外 ,其它均为阴性。结论 鼠疫耶尔森氏菌 inv基因高度同源 ,其间均有 IS15 41插入 ;

PCR-反相杂交法检测沙门氏菌invA、invE基因

目的 :探讨从血液中早期检出伤寒沙门氏菌病原体的方法。方法 :选择沙门氏菌属中的invAinvE ,采用PCR扩增 -反相杂交法及电泳法同时对血培养物中的伤寒沙门氏菌进行对比检测。结果 :电泳法 6h检出 8份 ,检出率 80 %。 8h、10h可将 10份全部检出 ,检出率为 10 0 %。反相杂交法 4h有 3份阳性 ,阳性率为 30 % ,6h有 9份出现阳性反应 ,阳性率为 90 % ,8h、10h可将 10份全部检出 ,阳性率为 10 0 %。临床标本中电泳法 12 / 16阳性 ,阳性率 75 % ,PCR -反相杂交法阳性 14/ 16 ,阳性率87.5 %。结论 :反相杂交法具有敏感性高、特异性好等优点 ,对伤寒的早期快速诊断及治疗有重要意义。

中国南瓜蔗糖转化酶(INV)基因的鉴定及进化和表达分析

蔗糖转化酶(INV)编码基因广泛参与植物的生长发育,在果实成熟期可影响果实品质。本研究利用生物信息学手段对中国南瓜INV基因家族进行鉴定和分析。结果表明,从中国南瓜中鉴定出18个INV基因家族成员,其功能分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶两大类。该家族成员在11条染色体上不均匀分布,且仅有1对串联重复基因。表达模式分析结果显示,CmoCh06G004890.1在根中的相对表达量高于其他INV基因家族成员,CmoCh01G010160.1和CmoCh06G004890.1在果实中的相对表达量较高。葫芦科作物INV系统进化分析结果表明,中国南瓜、印度南瓜和美洲南瓜的大多数INV基因均聚为一簇,具有较近的亲缘关系。本研究结果为进一步分析中国南瓜INV基因的生物学功能以及提高中国南瓜品质提供了一定的理论依据。

葡萄蔗糖转化酶基因家族的生物信息学及响应逆境胁迫分析

蔗糖转化酶(invertase,INV)在植物生长发育和抵御胁迫中发挥着重要作用。研究从葡萄基因组数据库中鉴定出19个蔗糖转化酶基因,对基因结构和编码蛋白质的理化性质进行生物信息学分析,并利用qRT-PCR技术分析基因在不同激素和非生物胁迫条件下的表达特征,为进一步探索葡萄INV基因家族参与葡萄逆境响应提供了一定的理论依据。结果表明,(1)该基因家族编码蛋白的氨基酸长度在150~766 aa之间,理论等电点介于4.43~9.1之间,亚细胞定位预测发现其主要在细胞质中表达,此外液泡和细胞壁也存在部分基因表达;(2)共线性结果显示VvCINV与其他5个物种复制频率较高;(3)保守基序分析表明VvCwINV包含了所有的保守基序,且Glyco_32和Glyco_hydro_100是VvINV基因主要结构域;(4)组织特异性表达分析发现多数基因在葡萄生长发育进程中都有表达;(5)qRT-PCR分析结果显示,VvINV基因家族在叶片中对激素处理和非生物胁迫的响应出现上调,VvCINV1在50 mg/L GA_(3)和10%PEG处理后上调表达极显著,VvCINV4在盐胁迫、ABA和低温处理后也上调表达显著。这些研究结果表明,VvINVs可能调控葡萄生长发育过程中激素和对非生物胁迫的响应。

鼠疫耶尔森菌的多重PCR检测方法

目的研究一种快速、特异的检测鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法选用针对鼠疫菌F1抗原基因、pla基因、inv基因和一段鼠疫特异染色体序列设计的4对引物,以鼠疫菌及其他肠道致病菌DNA为模板并加入内部对照模板,在同一扩增体系中进行PCR扩增。结果鼠疫菌DNA模板可扩增出预期产物,而其他菌株只能扩增出内部对照模板的片段。结论多重PCR方法具有较高的特异性。可迅速、有效地将鼠疫菌与其他肠道致病菌相鉴别,也可应用于鼠疫监测。

食品中沙门氏菌FTA膜结合跨越式滚环等温扩增检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的简便和快速现场检测,本研究采用FTA膜(Flinders technology associates,FTA)结合跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)方法(FTA-SRCA)建立一种新型的沙门氏菌检测方法。利用FTA膜快速提取模板DNA,根据沙门氏菌的inv A基因设计及筛选引物,建立FTA-SRCA反应体系。扩增反应在能够实现集约化检测的凹孔板中进行,反应结束后添加荧光染料观察结果。确定了该方法的特异性、灵敏度和人工污染样品的检出限,并对60个实际样品进行检测,评估其敏感性、特异性和符合率。结果表明:检测的17株沙门氏菌均为阳性结果,29株非沙门氏菌均为阴性结果,特异性良好。FTA-SRCA方法的灵敏度为6.81×100 CFU/m L,比PCR方法高100倍,比SRCA方法高10倍。对于人工污染的牛奶样品检测,FTA-SRCA方法的检出限为3.22×100CFU/m L,比PCR方法低1000倍,比SRCA方法低10倍。检测实际样品的敏感性、特异性和符合率分别为100.00%,94.64%,95.00%。本研究建立的FTA-SRCA方法具有操作简便快速、成本低廉、特异性强、灵敏度高、检出限低等优点,可用于食品中沙门氏菌的大批量集约化快速现场检测。

一例肾单位肾痨2型胎儿的产前超声表型及遗传学分析

目的对1例既往有胎儿双肾体积增大及羊水过少孕育史,本次妊娠16周余超声提示为双侧多囊性肾发育不良及羊水过少的引产胎儿行肾脏病理及分子遗传学检查,明确其病因,并为该家系的产前诊断和遗传咨询提供依据。方法对胎儿行超声检查明确其肾脏形态学改变,经遗传咨询后胎儿父母决定终止妊娠,取引产胎儿肾脏组织行病理学检查,通过目标区域捕获二代测序(next generation sequencing,NGS)对胎儿行遗传性肾脏疾病基因变异筛查,对胎儿及其父母行可疑致病基因变异位点Sanger测序验证。结果胎儿肾脏组织学检查提示为多囊性改变,未见正常的肾脏结构、肾皮质或髓质。NGS和PCR等检查明确胎儿携带INVS基因c.100+1G>A杂合变异和第3外显子杂合缺失,均为致病性变异,分别来自其母亲和父亲。结论对一个双侧多囊性肾发育不良引产胎儿明确诊断为肾单位肾痨2型(typeⅡnephronophthisis,NPHP2),对该家庭再次生育提供了精准的指导。NPHP2疾病的基因诊断在国内鲜有报道,本研究结果加强了对该类疾病临床表现和遗传学病因的认识。

环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用

目的:参照环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的基本原理、特点,并应用于假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis,Y.pseud)的检测。方法:应用LAMP技术,针对Y.pseud的inv基因设计合成6条引物(2条内引物,2条外引物及2条环引物),对12株耶尔森菌进行检测,并将其结果与传统结果相比较。结果:所检测的菌株样本中3株Y.pseud经LAMP检测均显绿色为阳性,而其余致病性和非致病性的Y.ent均显橙色为阴性。结论:LAMP方法快速、特异性强且操作简便,极适宜在基层实验室应用。