IP3R1基因沉默对鸭子宫上皮细胞Ca^(2+)转运的调控效应研究

本研究旨在探究IP3R1基因沉默后对鸭子宫上皮细胞增殖、胞内Ca^(2+)浓度和离子转运相关基因的影响。构建IP3R1基因shRNA干扰载体,利用Fluo-3/AM钙离子荧光标记法检测鸭子宫上皮细胞内Ca^(2+)浓度,CCK-8法检测鸭子宫上皮细胞的增殖情况,利用RT-qPCR法检测10个离子转运相关基因和4个细胞增殖相关基因的表达量。结果显示:IP3R1基因沉默后,细胞内Ca^(2+)浓度极显著升高,10个离子转运相关基因的表达发生变化,细胞也呈现增殖状态,进而影响了细胞增殖相关基因的表达。本研究结果揭示鸭子宫上皮细胞内IP3R1基因表达下调会影响细胞内Ca^(2+)稳态,改变钙转运相关基因mRNA的表达水平,并促进细胞增殖。

17β-雌二醇治疗围绝经期特发性室性心律失常疗效及对钙离子库受体IP3/Ryn2基因表达的影响

目的 观察17β-雌二醇治疗围绝经期特发性室性心律失常（idiopathic ventricular arrhythmia,IVA）临床疗效并研究其对钙离子库受体IP3/Ryn 2基因表达的影响,推断2者之间的关联性。方法 选择围绝经期特发性室性心律失常患者32例,同时选择32例同龄的围绝经期正常女性作为正常对照组。围绝经期IVA患者连续口服17β-雌二醇2个月。观察围绝经期IVA患者应用17β-雌二醇前后心律失常计数变化情况;检测围绝经期IVA患者治疗前、治疗后、正常对照者外周血钙离子库受体IP3和Ryn 2基因表达。结果 围绝经期特发性室性心律失常患者经17β-雌二醇治疗后室性心律失常计数较治疗前明显减少（P〈0.05）。与治疗前比较,经17β-雌二醇治疗后IP3基因表达明显下降（P〈0.05）,且同正常对照组相比无统计学意义。17β-雌二醇对Ryn 2受体基因表达无明显影响。结论 17β-雌二醇抑制特发性室性心律失常可能与钙离子库受体IP3基因表达相关。

针对IER3IP1基因的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建特异性针对IER3IP1基因的shRNA(Short Hairpin RNA)的真核表达载体,观察对IER3IP1基因表达的沉默作用,筛选出抑制效果较好的干扰片段。方法:针对IER3IP1基因,设计合成2对特异性DNA片段以及1对无关序列的阴性对照DNA片断,将它们插入真核表达载体pGenesil-1中构建重组质粒,质粒转染L02正常肝脏细胞株后,以半定量RT-PCR法检测转染后24、48、72hIER3IP1基因的抑制效果。结果:成功构建2个特异性针对IER3IP1的shRNA真核表达载体;所构建的载体中有1对能够特异性的降低L02细胞中IER3IP1的mRNA表达水平,且干扰效果显著,抑制率较高,与空载对照组比在转染后24、48、72h抑制率分别为64%、79%、69%。结论:设计构建的真核表达载体可以特异性干扰IER3IP1基因的表达,为进一步研究IER3IP1基因的功能奠定了基础。

IP3R1基因表达、变异对蛋鸭蛋壳品质的影响

IP3R1是钙释放通道蛋白,通过调控细胞质内Ca^2+浓度进而发挥其生物学功能。为探讨IP3R1基因对三穗鸭蛋壳品质的遗传效应,采用实时荧光量PCR和PCR产物直接测序法检测54只三穗鸭IP3R1基因的组织表达谱和SNP多态位点。结果表明:IP3R1 mRNA在11个组织中均存在不同程度的表达,其表达顺序为肺>心脏>肌胃>胸肌>肝脏>胰腺>肾脏>腺胃>子宫>小肠>脾脏;首次在IP3R1基因内含子14检测到g.253779 T>C和g.253967 C>A 2个SNPs突变位点,内含子18发现g.257089G>A、g.257159C>G和g.257237T>G 3个SNPs突变位点,5个SNPs位点均为中度多态位点;卡方(χ^2)检验结果表明,除g.257089G>A位点外,其余4个SNPs位点的基因型分布均未偏离Hard-Weinberg平衡;关联分析结果表明,g.257159C>G位点对蛋重和蛋壳重分别具有极显著和显著影响,g.257237T>G位点对蛋形指数的影响达显著水平(P<0.05)。结果提示,g.257159C>G和g.257237T>G可作为鸭蛋壳品质选择的遗传标记。

三穗鸭IP3R3基因SNP位点鉴定及其对蛋壳品质的影响

【目的】明确IP3R3对蛋壳性状的效应机制及其在蛋壳品质改良中的应用价值,为开展蛋壳品质改良分子标记育种提供参考依据,也为深入研究IP3R3基因的生物学功能打下基础。【方法】以288羽三穗鸭为研究对象,收集45周龄母鸭生产的鸭蛋,测定蛋重、蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋壳重;采用DNA直接测序法对三穗鸭IP3R3基因SNP位点进行鉴定,使用SHEsis进行单倍型及连锁不平衡分析,通过RNAfold预测不同单倍型的mRNA二级结构和自由能,并以SPSS 18.0中的一般线性模型(GLM)对三穗鸭IP3R3基因SNP位点与蛋壳品质进行关联分析。【结果】在三穗鸭IP3R3基因外显子上发现2个SNPs位点,分别位于第49外显子的g.35195T>C和g.35207G>A,均属于同义突变,且均存在3种基因型,对应的多肽信息含量(PIC)分别为0.330和0.276,属于中度多态位点(0.25<PIC<0.50)。g.35195T>C和g.35207G>A位点产生的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(χ^2-HWE<5.991),但2个SNPs位点间不存在强的连锁不平衡(Dʼ为1.000,γ^2为0.111)。2个SNPs位点联合可构建3种单倍型和6种双倍型,优势单倍型H3(TG)的频率为0.495,劣势单倍型H2(TA)的频率为0.208;单倍型H1、H2和H3的mRNA二级结构最小自由能分别为-475.50、-476.50和-476.10 kJ/mol,表明2个SNPs位点的突变能引起基因mRNA二级结构和自由能改变。g.35195T>C和g.35207G>A位点对三穗鸭蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋重和蛋壳重的影响均未达显著水平(P>0.05,下同);双倍型H1H1个体的蛋壳强度显著高于其他双倍型个体(P<0.05,下同),双倍型H2H2个体的蛋形指数显著低于其他双倍型个体,其他双倍型个体间均无显著差异。【结论】三穗鸭IP3R3基因与蛋壳品质有一定关联性。在三穗鸭IP3R3基因外显子上发现的2个SNPs位点能引起基因mRNA二级结构和自由能改变,其构建的双倍型可作为主效候选基因或与主基因紧密连锁的分子标记用于鸭蛋壳品质改良。

鸭产蛋循环中IP3R1、SLC4A4基因的组织表达及其对子宫Ca^(2+)浓度的影响

以三穗鸭为研究对象,于产蛋后0、2、5、16 h宰杀并采集各个组织,采用实时荧光定量PCR技术检测1型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R1)和碳酸氢钠协同转运蛋白(SLC4A4)基因在各组织中的表达水平,同时测定产蛋循环不同时期子宫的Ca^(2+)浓度,并进行相关分析.结果表明:0~2 h,IP3R1基因在子宫的表达量较低,5 h极显著增高(P<0.01),16 h达到最大值,差异极显著(P<0.01);16 h,IP3R1基因在肾脏、大肠的表达量极显著高于0~5 h(P<0.01);2 h,IP3R1基因在十二指肠的表达量极显著高于0、5、16 h(P<0.01),0 h的表达量极显著高于5、16 h(P<0.01);5 h,IP3R1基因在小肠的表达量显著低于0、2、16 h(P<0.05).16 h,SLC4A4基因在肾脏、大肠、子宫的表达量极显著高于0~5 h(P<0.01);2 h,SLC4A4基因在小肠的表达量显著高于0、5、16 h(P<0.05);0 h,SLC4A4基因在十二指肠的表达量极显著高于2~16 h(P<0.01).5 h,子宫的Ca^(2+)浓度极显著高于0~2 h(P<0.01),在16 h达到最大值,极显著高于0~5 h(P<0.01).0 h,肝脏IP3R1基因的表达量与子宫Ca^(2+)浓度呈显著正相关(P<0.05);5 h,胸肌IP3R1基因的表达量与子宫Ca^(2+)浓度呈显著负相关(P<0.05);16 h,小肠IP3R1基因的表达量与子宫Ca^(2+)浓度呈极显著负相关(P<0.01).5 h,脾脏SLC4A4基因的表达量与子宫Ca^(2+)浓度呈显著负相关(P<0.05);5 h,胰脏SLC4A4基因的表达量与子宫Ca^(2+)浓度呈极显著负相关(P<0.01).以上结果表明,鸭蛋壳形成过程中IP3R1、SLC4A4基因对子宫Ca^(2+)的转运具有一定的作用.

苦参碱处理的K562细胞中IER3IP1基因表达及其对细胞增殖的影响

目的研究苦参碱诱导 K562细胞分化过程中 IER3IP1基因的表达,以明确 IER3IP1基因表达与苦参碱作用的量效及时效关系,并初步探讨该基因在 K562细胞中的功能。方法锥虫蓝染色分析苦参碱对 K562细胞的生长抑制作用;用 RT-PCR 半定量方法观察 K562细胞在不同时间、不同剂量苦参碱作用下 IER3IP1基因的表达情况;对 IER3IP1基因重组质粒转染的 K562细胞(K562/eYFP-IER3IP1)作细胞形态学及细胞增殖变化的观察,同时进行细胞周期检测以及超微结构观察。结果苦参碱对 K562细胞有增殖抑制作用,在苦参碱作用3 h 后 IER3IP1基因表达可升高3～4倍,并呈剂量依赖性,其后6～48 h 表达下降,低于非苦参碱处理组。K562/eYFP-IER3IP1细胞的增殖速度显著减缓,G_0/G_1期细胞数升高(P<0.05);且苦参碱作用24 h 后在光镜和电镜下均可见红系分化细胞增多。结论苦参碱抑制 K562细胞生长,同时使 IER3IP1基因表达以剂量依赖的方式瞬时升高,转染了 IER3IP1基因的 K562细胞对苦参碱敏感性增高,提示该基因可能参与了苦参碱作用于 K562细胞的早期反应,并在后续的红系分化中发挥作用。

蛋鸭IP3R2基因多态性与蛋品质关联性分析

为了了解IP3R2基因对蛋鸭蛋品质的遗传效应,本研究以樱桃谷鸭、三穗鸭和兴义鸭为实验材料,采用PCR产物直接测序法对IP3R2基因g.70681~g.71200和g.71864~g.72386区域进行单核苷酸多态性筛查,应用一般线性模型分析多态座位对三穗鸭蛋品质的影响。结果显示,在IP3R2基因中g.70681~g.71200共检测到2个SNPs位点,分别为g.70868 C>T和g.70871 C>T,2个SNPs位点完全连锁,均位于内含子2,共检测到2种基因型:CC和CT,等位基因C的频率在3个鸭品种中均为优势等位基因,三穗鸭群体中该多态座位为低度多态座位,樱桃谷鸭和兴义鸭群体中均为中度多态座位,樱桃谷鸭群体的杂合度最高、有效等位基因数最大,分别为0.4758和1.9077,三穗鸭群体则最低,分别为0.2848和1.3982;卡方(χ^2)检验发现,该多态座位在樱桃谷鸭群体中基因型分布极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(p<0.01),三穗鸭和兴义鸭群体基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(p>0.05)。关联性分析表明,IP3R2基因多态座位对蛋黄色泽的影响达到显著性水平(p<0.05),CC基因型个体显著高于CT基因型个体(p<0.05),其他蛋品质指标在2个基因型间差异未能达到显著水平(p>0.05)。IP3R2基因g.70681~g.71200多态座位对鸭的蛋壳品质的影响未达显著水平,但却对蛋黄色泽有显著影响,为进一步研究其功能提供参考。

鸭产蛋循环中肌醇1,4,5-三磷酸(IP3R)受体基因的组织表达谱分析

肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-triphosphate receptor,IP3R)受体基因是Ca^(2+)跨膜转运活性的关键调控因子,会影响蛋壳品质。为了探究IP3R受体基因在鸭产蛋循环不同时期各组织的表达情况,笔者采用RT-PCR方法检测鸭产蛋后0 h、2 h、5 h和16 h IP3R受体基因在不同组织中的表达情况,并分析其表达调控效应。结果显示,IP3R受体基因在鸭不同产蛋时期各个组织中均存在表达;基因表达变化规律分析发现,子宫中IP3R受体基因的表达量在16 h内均最高(P<0.01),0~16 h肾脏和大肠中IP3R受体基因的表达量极显著升高(P<0.01);小肠和十二指肠中的表达量在0~16 h内极显著下降(P<0.01)。以上结果表明,鸭蛋壳形成过程中,IP3R受体基因的表达对子宫Ca^(2+)释放具有调控作用。本次研究结果为进一步研究IP3R受体基因在鸭蛋壳形成过程中对Ca^(2+)的调控机理提供了参考和理论依据。

Ataxin-3相互作用蛋白A3IP的克隆与细胞及组织定位的初步研究

目的根据前期筛选到的与ataxin-3蛋白羧基端相互作用的A3IP部分序列，进行A3伊基因的克隆，并探讨其细胞及组织定位情况。方法应用生物信息学及Northern印迹方法克隆A3IP基因并检测其转录本在人体组织和人脑不同部位的表达情况；应用Western印迹及免疫荧光方法检测A3IP蛋白在细胞中的表达及定位情况；应用免疫组织化学染色方法检测A3IP蛋白在人体各组织和人脑不同部位的表达及定位情况。结果对A3IP基因序列全长阅读框进行了cDNA克隆及序列拼接；检测了A3IP的3个转录本（1kb、1．35kb、6kb）在人体不同组织和人脑不同部位的表达谱；获得了A3IP-pEGFP在COS-7细胞和人大脑皮质、小脑、肌肉、周围神经、肝脏、肾脏的表达及定位情况。结论所克隆的AMP基因编码ataxin-3的一种相互作用蛋白A3IP，其3个剪切本在人体多种组织和人脑不同部位广泛表达，是一种细胞胞浆蛋白。