利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5%),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。

丁酸钠对IPI-2I细胞中Claudin-3表达的影响

以IPI-2I为细胞模型,利用1.5mmol·L-1丁酸钠对IPI-2I细胞进行处理,通过CCK8检测、通路阻断技术、蛋白质免疫印迹和实时荧光定量试验,探讨丁酸钠对IPI-2I细胞Claudin-3表达的影响及调控信号通路情况。结果表明:1.5mmol·L-1丁酸钠可通过激活细胞的GPR109A受体和Akt信号通路以增加细胞中Claudin-3的表达量。

丁酸钠对IPI-2I细胞中pIgR表达的影响

丁酸钠已被证实能够改善肠黏膜免疫功能,提高机体IgA分泌,但其机制尚不明确。本试验以猪回肠上皮细胞IPI-2I为细胞模型,利用2.0 mmol/L丁酸钠对IPI-2I细胞进行处理,通过荧光定量PCR、免疫蛋白印迹和信号通路阻断技术,观察丁酸钠对IPI-2I细胞pIgR表达的影响,并探讨其参与调控的信号通路。结果表明,2.0%mmol/L丁酸钠可通过激活IPI-2I细胞内GPR109A受体和ERK1/2信号通路进而增加pIgR的表达。

稳定表达ATP5a细胞系的建立

目的:通过慢病毒表达系统构建稳定表达ATP5a蛋白的猪回肠上皮细胞IPI-2I细胞系,筛选获得过表达ATP5a的稳定细胞株,为研究ATP5a介导的生物学功能在病毒复制中的作用提供细胞模型。方法:提取HEK 293细胞的cDNA为模版,通过PCR扩增将ATP5a基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒p LVX-ATP5a-IRES-Zs GReen1,利用慢病毒包装系统将重组质粒与辅助质粒PSPAI2、PMG 2.0按照3:2:1共转染293T细胞,48 h后收集细胞上清获得稳定表达ATP5a蛋白的慢病毒颗粒,将重组慢病毒颗粒感染IPI-2I细胞,利用流式筛选技术获得阳性细胞,通过Western Blotting验证ATP5a的表达。结果:成功构建ATP5a过表达慢病毒载体,并通过倒置荧光显微镜观察显示获得纯度高于90%的稳定表达细胞株,Western Blotting结果显示ATP5a蛋白可在细胞系中稳定表达。结论:本研究成功建立了稳定表达ATP5a蛋白IPI-2I稳定表达细胞系,为ATP5a蛋白生物学特性研究奠定了基础。