果蝇钙调蛋白和肌球蛋白NINAC相互作用分析

果蝇的视觉信号转导途径是已知的最快的G-蛋白偶联信号通路。这其中涉及到TＲP/TＲPL通道的开放以及钙离子的内流等一系列反应的形成。NINAC（neither inactivation nor afterpotentialC）是一种特异性存在于果蝇感光细胞中的第3类肌球蛋白（Myosin III），其在终止果蝇的视觉信号转导通路中起着非常重要的作用。NINAC蛋白具有两种亚型：一种是132 kD的蛋白亚型（p132），另一种则是174 kD的蛋白亚型（p174）。这两种不同的蛋白亚型都具有相同的激酶催化结构域（kinase domain），以及与肌球蛋白相似的马达结构域（motor domain）。但是，它们在C末端却存在着非常大的差异，这其中包括了钙调蛋白结合基序（IQ motif）。NINAC的这两种蛋白亚型在果蝇的感光细胞中的定位以及作用有很大不同，尤其是在与钙调蛋白的相互作用方面。钙调蛋白结合基序与钙调蛋白（CaM）之间的相互作用对于果蝇的视觉信号通路具有重要的意义：NINAC结合钙调蛋白能力的缺失将导致果蝇的视觉传导缺陷。本文通过蛋白共表达的方法，成功表达并纯化得到了不同版本的NINAC与钙调蛋白的蛋白复合物。静态光散射的结果表明，在Ca2 ＋存在情况下，p174蛋白可以结合2个Ca2 ＋-CaM，而p132只结合1个Ca2 ＋-CaM。通过分析型凝胶过滤以及等温量热滴定技术，进一步鉴定了p174及p132的IQ2（第2个钙调蛋白结合基序）序列与Ca2 ＋-CaM的相互作用。通过序列分析及进一步的突变实验发现，p174 IQ2中的3个疏水氨基酸（F1083，F1086和L1092）对于钙调蛋白的结合非常重要，并导致了p174与p132蛋白和Ca2 ＋-CaM结合能力的差异。本文的研究提供了NINAC与Ca2 ＋-CaM相互作用的生化机制，将为进一步在果蝇视觉信号通路中深入研究CaM是如何调节NINAC的体内功能实验打下基础。