载IR-780与多柔比星温敏脂质体的制备与表征

目的制备同时包封IR-780和多柔比星(DOX)的温敏脂质体并进行表征。方法采用薄膜水化法及硫酸铵梯度法制备载IR-780和DOX温敏脂质体(DOX-IR-780thermo-sensitive liposome,DITSL)。采用Malvern激光粒度仪检测各脂质体的粒径、表面电位及多分散系数(PDI);采用激光诱导DITSL升温释药,检测各脂质体的释药特性。结果 IR-780和DOX同时被包封于温敏脂质体,成功制备得DITSL。IR-780和DOX的包封率分别为(94.47±8.57)%、(92.52±7.61)%;平均粒径(138.98±8.74)nm;略带负电位;PDI为0.32±0.02。激光0.8 W/cm2照射5min,温度最高升到54.2℃,DOX释药率达80.1%。结论 DITSL具有药物包封率较高、粒径大小适宜、光热转化效率高、温度敏感性好的优点,并可通过激光控制释药,为下一步光热-化疗联合治疗肿瘤的研究奠定了基础。

IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤效应研究

目的探讨七甲川花菁类荧光小分子IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤作用。方法利用CCK-8试剂盒检测不同浓度IR-780(0、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000μmol/L)及IR-780联合阿霉素(0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400μmol/L)对4种不同肝癌细胞(QGY-7703、SMMC-7721、Huh-7和Hep G2)的杀伤效应,并确定后续实验IR-780和阿霉素的浓度,采用细胞划痕实验检测IR-780联合阿霉素对肝癌细胞迁移能力的影响;采用无血清悬浮培养的方法从Huh-7细胞株中分离并鉴定出具有干细胞特性的肿瘤细胞,检测IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的杀伤作用及迁移能力的影响;在裸鼠皮下荷瘤模型中观察IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞生长的抑制作用。结果低浓度的IR-780对肝癌细胞无明显杀伤作用;采用1.250μmol/L的IR-780联合阿霉素可对多种肝癌细胞产生较强的杀伤作用,其中半数致死浓度LC50较单药阿霉素降低25%;采用无血清悬浮培养的方法培养出Huh-7细胞肿瘤球,比较其与贴壁细胞的克隆形成能力、致瘤能力和细胞周期分布,证明悬浮培养的肿瘤细胞具有肿瘤干细胞特性;IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞具有较强的杀伤作用,单用阿霉素和IR-780联合阿霉素对肝癌干细胞样细胞的LC50差异有统计学意义[(0.30±0.02)vs(0.22±0.04)μmol/L,P<0.05];IR-780联合阿霉素可明显抑制肝癌干细胞样细胞的迁移能力和裸鼠皮下肿瘤的生长。结论 IR-780可增强阿霉素的抗肿瘤作用,提高对肝癌干细胞样细胞的杀伤效应。

近红外荧光染料IR-780在肾透明细胞癌中的成像特征

背景:课题组研发了一组可以直接与肿瘤细胞结合的有机近红外荧光染料,IR-780是其中的优秀代表。目的:评估近红外荧光染料IR-780在肾透明细胞癌中的特异性成像效果。方法:取对数生长期的人肾透明细胞癌细胞786-O、ACHN和正常人胚肾细胞293T,分别与20μmol/L荧光染料IR-780共孵育30 min,激光共聚焦显微镜下观察染料在肾透明细胞癌细胞中的成像。取对数生长期的人肾透明细胞癌细胞786-O,与20μmol/L近红外荧光染IR-780共孵育30 min,激光共聚焦显微镜下观察染料在细胞线粒体与及溶酶体内的定位。在人血液样本中分别加入10,100,1 000,10 000个DAPI染色的人肾透明细胞癌细胞786-O,分离培养各组单个核细胞,再与20μmol/L近红外荧光染料IR-780共孵育30 min,激光共聚焦显微镜下观察DAPI和IR780双阳性染色细胞。结果与结论:(1)近红外荧光染料IR-780具备使多种肾透明细胞癌细胞显像的能力,对正常肾胚上皮细胞则无此能力;(2)近红外荧光染料IR-780与溶酶体或线粒体均有明显的染色重叠,验证了IR-780在膜性细胞器线粒体和溶酶体内的选择性聚集作用;(3)近红外荧光染料IR-780可检测到血液中微量的肾透明细胞癌细胞;(4)结果表明,近红外荧光染料IR-780能够在肾透明细胞癌细胞内特异性蓄积,可用于血液中肾透明细胞癌细胞的特异性诊断。

壳聚糖/β-甘油磷酸钠/胶原水凝胶包裹IR-780碘化物标记肌腱干细胞的体内示踪研究

目的探讨肌腱干细胞(TSCs)用IR-780碘化物标记之后的生物学特性以及壳聚糖(C)/β-甘油磷酸钠(GP)/胶原(Co)水凝胶包裹IR-780碘化物标记TSCs的体内示踪情况。方法 14只雄性SD大鼠(4周龄,体重约100g),2只用于提取大鼠TSCs,4只用于活体成像观察,8只用于组织学分析。用酶消化法提取大鼠跟腱来源TSCs,用IR-780碘化物标记TSCs,激光共聚焦显微镜下观察IR-780碘化物标记TSCs的细胞内定位,用流式细胞术检测其标记阳性率及对TSCs细胞周期的影响,用CCK-8法检测IR-780碘化物标记TSCs对其增殖的影响,用C/GP/Co水凝胶包裹IR-780碘化物标记的TSCs移植至大鼠跟腱损伤部位。通过全身近红外成像及组织学观察,检测TSCs在大鼠体内的存活及分布情况。结果成功提取大鼠跟腱来源TSCs,并成功制作C/GP/Co水凝胶。IR-780碘化物可成功标记TSCs,其标记阳性率为95.75%,荧光强度显著高于对照组,且对TSCs的细胞周期及增殖无明显不良影响。通过全身近红外成像及组织学观察,很容易检测到大鼠跟腱损伤区域IR-780碘化物标记的TSCs,荧光信号在大鼠身体其他部位几乎检测不到。从1~28d,IR-780碘化物的荧光信号逐渐减弱,但28d时仍能检测到明显荧光。结论 IR-780碘化物可有效标记TSCs,其标记阳性率为95.75%,且对TSCs的细胞周期及增殖无明显不良影响;IR-780碘化物标记的TSCs即使在28d时也有明显可检测的荧光;TSCs包裹在C/GP/Co水凝胶内移植至大鼠跟腱损伤部位,至少存活了4周。C/GP/Co水凝胶包裹TSCs可用于大鼠跟腱损伤的体内实验研究。

线粒体靶向小分子IR-780对顺铂耐药膀胱癌细胞的杀伤效应

目的探讨线粒体靶向小分子IR-780对顺铂耐药T24膀胱癌细胞株(T24/DPP)的杀伤效应及其作用机制。方法通过顺铂反复间断刺激T24细胞,构建T24/DPP耐药细胞株,以不同浓度的IR-780处理细胞,CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,荧光共聚焦确定IR-780的亚细胞器定位,流式细胞术测定细胞凋亡以及线粒体活性氧水平。对6~8周龄雄性裸鼠皮下注射T24/DPP细胞建立动物荷瘤模型,将荷瘤小鼠完全随机化分组:对照组、阿霉素组和IR-780组分别腹腔注射5 mg/kg PBS、阿霉素和IR-780,隔天1次。通过近红外活体成像以及荧光共聚焦检测IR-780的蓄积特性,并对肿瘤生长情况进行监测。结果①细胞实验结果显示,IR-780抑制T24/DPP细胞增殖与迁移,且抑制作用呈明显的剂量效应关系(P<0.05)。IR-780选择性积聚在T24/DPP细胞的线粒体中。随着IR-780浓度的增加,T24/DDP细胞线粒体活性氧的产生和细胞凋亡率均随之增加(P<0.05)。②体内实验结果显示,近红外活体成像和肿瘤组织冰冻切片显示IR-780可优先聚集于裸鼠T24/DDP皮下移植瘤,并且IR-780组小鼠肿瘤的体积及质量均明显小于对照组(P<0.05)和阿霉素组(P<0.05)。结论IR-780能显著抑制T24/DPP细胞和裸鼠皮下肿瘤的生长,且线粒体通路可能参与了IR-780诱导T24/DPP细胞发生凋亡的过程。

IR780光热治疗耐药性三阴乳腺癌的实验研究

目的探索光热转换剂IR-780对于耐药性乳腺癌细胞的光热干预效果。方法通过MTT法检测IR-780对于人乳腺癌细胞多药耐药株MCF-7/ADR的抑制率,设置不同的浓度及光照时长,以判断对细胞的光热干预差异。结果在无辐照条件下,IR-780对细胞无明显毒性;在光辐照条件下,则呈现出明显的细胞杀伤效果。抑制效果与光热转换剂浓度及照射时间有明显的量效关系。结论IR-780可有效杀伤耐药性乳腺癌细胞,可为进一步开发耐药性乳腺癌治疗的新方法提供理论依据。

水溶性IR-780聚合物用于线粒体靶向的光动力治疗

11-氯-1,1’-二正丙基-3,3,3’,3’-四甲基-10,12-三亚甲基吲哚三碳花青碘盐(IR-780)被具有较强组织穿透能力的近红外光照射后,能快速高效地产生活性氧,导致细胞死亡,可用于光动力治疗.但是IR-780的水溶性差,这极大限制了其生物医学应用.基于此我们设计合成了可高效靶向线粒体的水溶性IR-780聚合物Poly-IR, Poly-IR在水中自组装成为纳米粒子.Poly-IR纳米粒子受近红外光激活后,在肿瘤细胞内外均能快速高效地产生活性氧,并且该纳米粒子能够在线粒体中富集,受近红外光的激发后产生的活性氧能够破坏线粒体,导致线粒体膜电位降低.细胞毒性、活死细胞染色及凋亡实验结果也进一步证明,该纳米粒子在近红外光照下能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖.本体系为靶向线粒体的光动力治疗肿瘤领域拓展了思路.

新型花菁近红外荧光探针CySeN的合成及其识别性能

硒-氮共价键(Se-N)具有活泼易断裂的化学性质,一定条件下具备化学开关式的调控性能。以IR-780碘化物作为荧光染料,与依布硒啉衍生物缩合合成了含有Se-N化学开关的新型花菁近红外荧光探针CySeN,结构得到核磁共振氢谱和碳谱以及高分辨质谱(HR-MS)确认。该探针对丙酮具有非线性响应识别能力,可用于激光共聚焦细胞成像,但对丙酮的荧光增强不明显,高分辨质谱对其识别机制的分析结果表明,Se-N键的断裂以及丙酮-硒共价化合物CySeA的形成是丙酮识别的主要原因。

共递送IR-780及18β-甘草次酸的还原敏感胶束型纳米粒的构建及其抗肿瘤效果评价

光热治疗(photothermal therapy,PTT)是一种高效的抗肿瘤手段,但在激光照射消融肿瘤的同时,通常会引发一系列炎性反应,促进肿瘤的进一步发展,影响肿瘤治疗效果。因此,在肿瘤光热治疗的同时,实现对抗炎药物的肿瘤精准靶向递送,抑制光热治疗引发的炎性反应,是提高抗肿瘤效果的有效手段。为此,本课题以还原敏感连接物3,3'-二硫代二丙酸(DA)键合疏水段抗炎药物18β-甘草次酸(18β-GA)和亲水段甲氧基-聚乙二醇-氨基(mPEG-NH_(2))得到还原敏感的两亲性聚合物PEG-DA-GA,并包载光热剂IR-780,制备得到还原敏感胶束型纳米粒PDG/IR-780 NPs。PDG/IR-780 NPs的粒径均一,为80.2±5.3 nm,多分散指数(PDI)为0.215±0.079。所有动物实验遵循四川大学伦理委员会制定的伦理学要求。结果表明,与非还原敏感的对照纳米粒PSG/IR-780 NPs相比,PDG/IR-780 NPs可响应肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽,促进纳米粒解体,有效释放出18β-GA,对4T1细胞的杀伤效率显著提升。肿瘤组织的冰冻切片实验结果表明,与游离药物组相比,所设计的PDG NPs可提高药物在肿瘤的分布。最后,PDG/IR-780 NPs在小鼠4T1三阴性原位乳腺癌模型中表现出显著的抗肿瘤疗效,为肿瘤光热治疗提供了新的思路。

近红外荧光探针和成像系统临床转化应用的初步探索

目的围绕近红外荧光成像探针、成像系统和临床转化评价开展探索,为进一步研发和应用提供依据。方法应用FDA批准的吲哚菁绿(ICG)评价近红外成像在复杂创面伤情评估中的价值,应用课题组前期发现的具有肿瘤靶向特性的近红外染料IR-780评价其在外科手术切除肿瘤组织及淋巴结成像中的意义。通过对IR-780的动物体内成像实验对课题组协作研发的近红外荧光成像系统进行评价。结果应用ICG能够清晰实现糖尿病足和烧伤手指的血管成像,反映血液供应情况,对于评判血管闭塞程度和指导手术治疗具有潜在应用价值;应用IR-780能够实现对手术切除肿瘤病灶的识别及淋巴结显影,初步显示出潜在转化应用前景;通过对IR-780的动物成像研究显示,协作研发的近红外成像系统TPS-785-Ⅲ具有良好的成像功能,为后续开发奠定基础。结论近红外荧光成像显示出良好的临床应用前景,通过对近红外荧光探针和成像系统的进一步研究评价,可望为临床诊断治疗提供新的手段。

去氢骆驼蓬碱光敏性脂质体的构建及其体外抗宫颈癌侵袭作用研究

尽管HPV疫苗及筛查方案的逐渐成熟,但宫颈癌仍然在严重威胁女性生命健康。早期宫颈癌的治疗以手术为主,拟通过热疗增强化疗作用,保留患者宫颈部位完整,提高治疗效果,为宫颈癌早期治疗提供更多治疗依据。采用薄膜分散法制备同时包载去氢骆驼蓬碱(HM)、染料IR-780的光敏性脂质体,筛选最佳条件是磷脂胆固醇膜材质量比为8∶1,药脂质量比为1∶20;通过Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱进行分离,采用HPLC测定去氢骆驼蓬碱包封率为55.6%±0.18%;在透射电镜下观察形态圆整,分布均匀;马尔文粒度仪测定粒径为(125.2±0.62)nm及Zeta电位为(-2.55±0.76)mV;光热转换效率是光热剂的重要属性,经测定光热转换效率为27.1%±0.86%;在4℃的贮存条件下,在前14 d的包封率较稳定,无絮凝现象;并采用磺酰罗丹明B蛋白(SRB)法考察脂质体对HeLa细胞在近红外照射下的抗增殖作用比无红外照射作用强;采用Transwell实验考察脂质体对HeLa细胞的抑制侵袭迁移作用,明显抑制HeLa细胞的体外迁移和侵袭的能力。该研究为去氢骆驼蓬碱治疗宫颈癌提供更多研究基础。