中国荷斯坦奶牛乳腺炎相关基因IRAK2基因诊断方法的研究

为了研究奶牛乳腺炎相关基因IRAK2第7外显子SNP基因多态性,试验根据GenBank中IRAK2基因序列设计引物,PCR扩增得到281 bp和279 bp的IRAK2基因片段,将所得的片段经PCR-SSCP方法和RsaⅠ内切酶酶切检测后均出现3种基因型。结果表明:获得的基因型与NCBI中报道的一致。说明用PCR-SSCP联合酶切方法建立IRAK2基因快速诊断方法是可行的。

miR-16-5p、IRAK2基因对关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察miR-16-5p、IRAK2基因对脂多糖(LPS)诱导的胎鼠骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法剪取胎鼠膝关节获取软骨细胞,常规传代培养。通过靶基因预测网站starBase预测miR-16-5p靶基因,采用荧光素酶报告基因实验进行验证。取对数生长期软骨细胞分成8组。LPS组加入LPS诱导骨关节炎软骨细胞模型,NC组加入等量培养基;LPS+miR-16-5p组转染miR-16-5p模拟物(miR-16-5p mimics)后加入LPS,LPS+miR-con组转染对照模拟物(miR-con)后加入LPS;LPS+si-IRAK2组转染IRAK2 siRNA(si-IRAK2)后加入LPS,LPS+si-con组转染对照siRNA(si-con)后加入LPS;LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组转染miR-16-5p mimics、IRAK2过表达质粒(pcDNA-IRAK2)后加入LPS,LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组转染miR-16-5p mimics、对照质粒(pcDNA-con)后加入LPS。采用qRT-PCR法检测NC组、LPS组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA;采用MTT法测算各组细胞增殖能力(以细胞存活率表示细胞增殖能力);采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率;采用Western Blotting法检测各组细胞中IRAK2、细胞周期蛋白1(CyclinD1)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白。结果LPS组细胞中miR-16-5p、IRAK2 mRNA的相对表达量分别为1.00±0.10、4.01±0.41,NC组分别为5.33±0.53、0.85±0.09,两组相比,P均<0.05。LPS组、NC组细胞存活率分别为63.03%±6.31%、100.00%±10.26%,LPS+miR-16-5p组、LPS+miR-con组分别为93.16%±9.32%、65.46%±6.53%,LPS+si-IRAK2组、LPS+si-con组分别为91.46%±9.15%、60.45%±6.05%,LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组分别为68.08%±6.81%、93.16%±9.31%,两组间相比,P均<0.05。LPS组、NC组细胞凋亡率分别为28.46%±2.85%、1.59%±0.16%,LPS+miR-16-5p组、LPS+miR-con组分别为5.09%±0.51%、30.01%±3.02%,LPS+si-IRAK2组、LPS+si-con组分别为4.88%±0.50%、29.10%±2.91%,LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组、LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组分别为20.89%±2.10%、6.15%±0.62%,两组间相比,P均<0.05。LPS组细胞中IRAK2、CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白相对表达量分别为1.20±0.12、0.40±0.04、0.90±0.09、0.25±0.03,NC组分别为0.35±0.05、1.00±0.10、0.10±0.02、0.85±0.09,两组相比,P均<0.05;LPS+miR-16-5p组分别为0.90±0.09、0.28±0.03、0.75±0.08、0.10±0.02,LPS+miR-con组分别为0.42±0.05、0.92±0.09、0.30±0.05、0.88±0.08,两组相比,P均<0.05;LPS+si-IRAK2组分别为0.55±0.06、0.92±0.09、0.30±0.03、0.80±0.08,LPS+si-con组分别为1.20±0.12、0.42±0.05、0.90±0.09、0.32±0.05,两组相比,P均<0.05;LPS+miR-16-5p+pcDNA-IRAK2组分别为1.10±0.10、0.55±0.05、0.80±0.08、0.42±0.05,LPS+miR-16-5p+pcDNA-con组分别为0.52±0.05、0.92±0.09、0.32±0.05、0.84±0.05,两组相比,P均<0.05。结论LPS诱导的胎鼠骨关节炎软骨细胞中miR-16-5p低表达、IRAK2高表达,上调miR-16-5p表达、下调IRAK2基因表达均可促进软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡,其作用机制可能与CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白表达有关。

miR-150及其靶基因IRAK2在变应性鼻炎小鼠模型中的表达

目的探讨miR-150及其靶基因IRAK2在变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中的表达及其作用。方法SPF级Balb/c小鼠20只,随机分为两组,变应性鼻炎模型组(AR)、对照组(NC),每组10只。模型组用卵清蛋白(OVA)致敏建立变应性鼻炎小鼠模型;对照组使用生理盐水替代。每组随机取4只小鼠,病理检查;每组剩余6只小鼠取其鼻黏膜,实时定量PCR检测小鼠鼻黏膜中miR-150及IRAK2 mRNA表达水平,蛋白印迹法(Western blot)检测IRAK2蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中OVA特异性IgE、IL-4、IL-13的含量,模型组与对照组miR-150相对表达量与IRAK2 mRNA的相对表达量、OVA特异性IgE、IL-4、IL-13的相关性分析采用Pearson相关性分析。结果AR组小鼠动物行为学评分均大于5分;病理组织HE染色显示AR组鼻黏膜纤毛大量脱落,组织间质水肿、小血管扩张、腺体增生、炎性细胞浸润;血清OVA特异性IgE、IL-4、IL-13表达增加。AR组小鼠鼻黏膜miR-150表达较NC组降低(P<0.05);IRAK2 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05);且AR组鼻黏膜IRAK2蛋白表达水平也比NC组增加(P<0.05)。AR组与NC组miR-150相对表达量与IRAK2 mRNA表达量和OVA特异性IgE、IL-4、IL-13的含量呈负相关(r=-0.841、-0.869、-0.834、-0.857,P<0.05)。结论miR-150在变应性鼻炎模型小鼠中表达降低且与IRAK2、OVA特异性IgE、IL-4、IL-13含量存在负相关,二者的表达差异可能在变应性鼻炎的发生发展中发挥作用。