加拿大政府支持中小企业创新发展举措的研究——基于NRCIRAP计划

国家研究委员会工业研究资助项目(National Research Council Canada in Industrial Research Assistance Program,NRC IRAP)是加拿大政府支持创新的旗舰项目之一,是促进加拿大中小企业科技创新、技术转移转化的一项重要举措。通过对NRC IRAP的发展历程、核心组织结构、创新支持服务内容和评估改进考核制度等进行分析梳理,总结其具有“资金+咨询”并重的服务模式、服务体系机动灵活、注重建立广泛合作伙伴关系以及关注代表性不足群体创新发展等特点。最后,基于NRC IRAP的特色项目内容及管理制度,就优化中国有效支持中小企业创新发展提出启示及经验借鉴。

基于IRAP标记的沙子空心李遗传多样性评价及指纹图谱构建

通过走访调查,选取92株具有优良性状的沙子空心李种质,根据李反转录转座子的RT序列开发IRAP标记引物,设计L16(43)的正交试验优化10μL IRAP-PCR主要影响因素的含量;利用18条IRAP引物对92份沙子空心李进行遗传多样性分析,构建供试种质的指纹图谱。结果显示:最优的10μL IRAP-PCR反应体系为10^(-5)mol/L IRAP引物l.3μL,PCR Mix 5.0μL、模板DNA(30 ng/μL) l.0μL,PCR循环40次。18条IRAP引物共扩增出189个位点,多态性位点180个,等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon指数均值分别为1.930、1.426、0.261及0.405。采用邻接法将92份沙子空心李聚类为4个类群。确定IRAP引物Ty3-2及Ty3-6为核心引物,可高效构建92份供试种质的指纹图谱。

茄子IRAP和REMAP分子标记的开发

根据烟草和大麦中反转录转座子Bare-1和Tto1的LTR保守区域设计引物,对14份茄子材料进行PCR扩增,分别采用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物,建立了茄子IRAP(inter-retrotransposon amplifiedpolym orphism)和REMAP(retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism)分子标记技术体系。两种方法均得到了多态性丰富的指纹图谱,为茄子品种鉴定和指纹图谱构建提供了新途径。

烟草种质资源遗传多样性的IRAP和ISSR标记比较分析

采用IRAP和ISSR两种分子标记方法,对国内外28份烟草种质资源进行聚类分析,并对两种方法的结果予以比较。结果如下:(1)用IRAP方法对供试材料进行PCR扩增,共得到214条条带,其中187条具有多态性,多态性比率达87.4%。当L1取值0.495时,可将28份材料划分为3个类群;L2取值0.34时,又可将第3类群划分为3个亚类群和3个单一品种组成的独立个类;(2)用ISSR方法进行PCR扩增时,共得到334条条带,其中250条有多态性,多态性比率为75%。当L1取值0.41时,可将28份烟草种质划分为2个类群和2个独立个类Coker176、BaSm aUovina,第一类群(Ⅰ)为来自美国的两个品种RG11和K730,其它24个品种为第二类群(Ⅱ);(3)IRAP和ISSR两种方法的相关系数为0.823(r0.01=0.478),说明这两种方法的结果高度相关,均可用来进行烟草种质资源遗传多样性的分析。用IRAP方法得到的品种间遗传相异系数(GD)平均为0.423,高于ISSR方法,而且条带更稳定、多态性比率更高,更易揭示不同品种材料的遗传差异。

IRAP分子标记在茄子种质资源亲缘关系分析中的应用

参考马铃薯和烟草的反转录转座子LTRs保守区域设计引物,对34份茄子材料进行PCR扩增,得到了多态性丰富的指纹图谱。聚类分析将34份茄子材料分为三大类群,表明IRAP分子标记适合于茄子种质资源的亲缘关系分析。

基于SSR和IRAP标记的‘关口葡萄’亲缘关系分析

【目的】‘关口葡萄’是湖北建始县的"地理标志产品",但其品种来源和分类学地位有待明确。【方法】以‘关口葡萄’为试材,以其他14份葡萄种质包括5份欧亚种(Vitis vinifera L.)、6份欧美杂交种(V.vinifera×V.labrusca)以及3份美洲种(V.labrusca)为对照;采用SSR和IRAP分子标记技术,通过对供试材料间亲缘关系的分析而鉴定其身份。【结果】利用筛选出的16对SSR引物以及10条IRAP引物对供试材料基因组DNA的扩增结果表明,两种标记共扩增271条清晰、可重复谱带,其中多态性带264条,多态性比例分别为99.41%和94.12%;应用NTSYS-pc version2.10e软件进行聚类分析,两种标记的树状图结果均显示‘关口葡萄’与欧美杂交种‘尼加拉’和‘白香蕉’亲缘关系最近,与美洲种‘康可’和‘郑果6号’亲缘关系较近,而与其他欧亚种品种的遗传关系相对较远。【结论】‘关口葡萄’属欧美杂交种,其既非‘尼加拉’也非‘白香蕉’,但其来源可能与二者有关。

基于马尾松反转录转座子序列的IRAP分子标记开发及应用

[目的]为了丰富马尾松遗传信息,开发更多适用于马尾松的新型分子标记。[方法]依据马尾松Ty1-copia类型和Ty3-gypsy类型反转录转座子RT序列的保守区域设计引物,建立了马尾松IRAP-PCR技术体系并以12个基因型个体为材料进行验证。[结果]42条引物中筛选出多态性丰富、重复性好的29条进行PCR扩增,共获得227条谱带,其中多态性条带207个,多态性比例为91.19%,平均观测等位基因数(Na)为1.911 9±0.284 1,有效等位基因数(Ne)为1.468 0±0.288 2,Nei’s基因多样性指数(H)为0.291 1±0.144 9,Shannon’s信息指数(I)为0.447 2±0.195 3;利用引物P-12、P-15或R-1,可以将栽培种与无性系两类区分开;P-2可作为核心引物,能将12份供试材料有效区分开来;采用IRAP标记构建了供试种质的DNA指纹图谱;供试种质的遗传相似系数为0.46 0.69,以相似系数为基础,进行UPGMA聚类分析,以0.57为阈值可将供试种质分为三类,其中无性系内不同材料间也存在较大的遗传变异。[结论]IRAP分子标记能有效地用于马尾松种质的鉴别与亲缘关系分析等相关研究。

梨Ty1-copia反转录转座子的克隆及IRAP分子标记体系的建立

【目的】从早酥梨及其红皮芽变基因组中分离Ty1-copia反转录转座子全长序列,分析序列特点,并基于其中长末端重复序列(LTR)建立IRAP分子标记体系。【方法】以早酥梨及其红皮芽变和极早熟芽变植株叶片为试材,根据已知的Ty1-copia反转录转座子保守区域设计引物,利用同源克隆技术得到目的基因。根据基因两端LTR序列设计引物,建立IRAP分子标记体系,并对早酥梨及其芽变进行遗传分析。【结果】从早酥梨基因组中获得2条Ty1-copia反转录转座子全长序列,分别命名为PbTYZS1和PbTYZS2,长度分别是9 363和9 632bp。从红色芽变基因组中获得1条序列,命名为PbTYRM1,长度为9 652bp。经结构分析,获得的3条序列都是典型的Ty1-copia反转录转座子,但其开放阅读框(ORF)的完整性发生了变化。利用反转录转座子LTR保守区域设计引物成功建立了IRAP分子标记体系,早酥梨与红皮芽变的平均遗传距离为0.104,与极早熟芽变的遗传距离为0.115,并且早酥梨与极早熟芽变的多态性为20.41%,较之与红皮芽变的多态性(18.89%)更为丰富。【结论】早酥梨及其红皮芽变基因组中都含有完整结构的Ty1-copia反转录转座子,建立的IRAP分子标记体系可以得到清晰稳定的多态性指纹图谱。

利用IRAP技术揭示部分柿属种间遗传关系

【目的】为了明晰柿属植物种间亲缘关系和探究逆转座子与该属植物倍性进化的相关性,【方法】以16种24份柿属植物为试材,利用IRAP(Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism)技术和UPGMA聚类分析。【结果】采自我国南热带的供试基因型独自成组,与其采集地域相吻合,反映了它们较古老的分类学地位;采自我国北亚热带和温带的基因型独立于南亚热带基因型组,含丰富的染色体倍性,且相互间混聚在一起,无明显地域趋同性,反映了该区域基因型间广泛的基因交流和适应性进化;从UPGMA聚类图反映的不同区域柿属基因型间的相对位置来看,逆转座子活性与其倍性进化及生态适应性间存在明显的相关性。【结论】采自我国南亚热带的柿属植物可能更加古老;逆转座子在柿属种间倍性进化过程中可能发挥了一定的作用。

利用IRAP标记分析烤烟品种间遗传差异

利用基于反转录转座子（IRAP）的分子标记技术分析了59份烤烟品种间遗传差异.结果表明,根据烟草反转录转座子Tnt1、Tto1、Tnd-1序列设计的5个引物共扩增出151条带,其中多态性带145条.每个引物检测到多态性带10～51条,平均为29条.供试材料间遗传相似系数变幅为0.140～0.760,平均为0.540.通过聚类分析可将参试品种分为14个类群,国内大多数推广品种、育成品种被聚在类群Ⅰ,说明其遗传基础比较狭窄;地方品种翠碧1号、小黄金1025、黄苗榆和净叶黄等各自聚为独立的类群,可利用它们作为杂交亲本来拓宽烤烟品种的遗传基础.

梅(Prunus mume)IRAP分子标记技术体系的建立

基于梅Ty1-copia类逆转座子的长末端重复序列信息设计IRAP引物,通过五因素四水平L16(45)的完全随机正交试验、不同浓度PAGE胶等的研究,建立了适合梅IRAP标记的技术体系。结果表明,体系总体积25μL,其中基因组DNA 30 ng、25 mmol·L-1 MgCl2 2.0μL、2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.5μL、10×PCR Buffer 2.5μL、Taq DNA聚合酶1.0 U、10μmol·L-1 LTR引物1.0μL,加ddH2O至25μL为最优IRAP的PCR反应体系,以及6.0%和8.0%浓度的非变性PAGE胶均适于IRAP多态性检测。这为进一步利用IRAP分子标记研究梅的遗传多样性和亲缘关系等奠定坚实的基础。

茄子IRAP分子标记体系的建立与优化

为确保茄子IRAP反应结果的稳定性和重复性,进而为茄子遗传多样性分析和品种鉴定提供可靠的新方法,按照已报道的马铃薯和烟草的反转录转座子LTRs保守区域设计IRAP引物,以茄子品系HL-01为试材,对影响茄子IRAP反应的重要因素进行了初步研究,建立并优化了茄子IRAP分子标记技术体系。优化的茄子IRAP分子标记体系为:20(l反应液中,10×反应buffer(100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,80mmol/L(NH4)2SO4,pH9.0,NP-40)2μl,2mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTPs,Taq-l.0U,0.4μmol/L引物,DNA模板50ng。PCR反应程序为:94℃预变性4min,然后按94℃变性30s,45℃退火30s,72℃延伸2min,进行32个循环,最后72℃延伸10min。

利用IRAP分子标记对小麦抗旱品种筛选的研究

采用IRAP分子标记方法,设计引物对36份小麦材料进行PCR扩增,得到多态性丰富的指纹图谱,并进行聚类分析。结果显示：扩增出清晰稳定条带246条,片段大小多集中在250～2 000 bp,多态性位点总计13个,各个品种扩增的位点数为0～12个,聚类分析结果能够反映36份小麦材料抗性有无以及强弱关系,表明IRAP分子标记适合应用于小麦抗旱品种筛选的研究分析。

江西柿属种质资源遗传多样性的IRAP标记分析

利用逆转座子间扩增多态性(Inter-retrotransposon Amplified Polymorphism,IRAP)分子标记对收集的49份江西柿属种质资源进行了遗传多样性分析。从26个IRAP引物中筛选出扩增条带清晰且多态性丰富的10个引物,PCR扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)得到清晰的指纹图谱。将418条清晰条带(多态性100%)转换为0/1矩阵,聚类分析结果表明:供试的江西柿属种质资源的遗传相似系数在0.69~0.92之间,分属柿、油柿、野柿三个种,遗传多样性丰富;明晰了几个分类关系模糊的柿种质资源的种属关系。

37份新疆粳稻品种(系)的IRAP遗传多样性分析

该研究基于4个稻属(Oryza)反转录转座子,包括活性、低拷贝[Tos17/Osr21(Ty1-copia)和RIRE7/Osr31(Ty3-gypsy)]和非活性、高拷贝[Osr34(Ty3-gypsy)和Houba/Tos5/Osr13(Ty1-copia)],在两侧翼长末端重复序列(LTR)区域分别设计引物,对37份新疆粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)栽培品种(系)进行PCR扩增。评估鉴定适用于反转录转座子插入位点间扩增多态性(IRAP)标记方法,并分析37份供试品种(系)的遗传多样性。(1)PCR扩增结果显示,Tos17/Osr21、RIRE7/Osr31、Osr34和Houba/Tos5/Osr13依次获得73、63、107和560条谱带,其中多态性条带36、63、70和523个,多态性比率为49.3%、100.0%、65.4%和93.4%。(2)综合评估比较多态性、异质性、总谱带数和平均多态性谱带数发现,Houba/Tos5/Osr13适用于IRAP标记方法构建DNA指纹图谱数据库。(3)以Houba/Tos5/Osr13遗传相似系数为基础,对供试品种(系)采用非加权平均(UPGMA)法进行聚类分析显示,以0.55为阈值将37份新疆粳稻栽培品种(系)分为6大类群,绝大多数品种(系)得到了明确的区分,品种间的遗传相似性较高,多样化程度偏低;品系‘20-18’和‘96-16’分别各自聚为一类,表明品系与品种间遗传背景较远,多样化程度较高。综上所述,IRAP分子标记适用于新疆粳稻种质资源的亲缘关系分析、鉴别及育种遗传距离的判定和DNA指纹图谱数据库构建等相关研究,在实际育种中选取不同类群的水稻品种与品系进行杂交选育,成功率较高,可能会大大缩短优良品种的选育进程。

苹果IRAP反应体系的建立和指纹图谱构建

利用已获得的苹果Ty1-copia类逆转座子LTRs建立了苹果逆转座子间扩增多态性(IRAP)技术体系,对影响IRAP-PCR扩增结果的若干因子进行了研究。优化的反应体系包含:2.5μL10×buffer,50 ng模板DNA,2.5mmol.L-1Mg2+,0.2 mmol.L-1dNTPs,0.4μmol.L-1引物,1 UTaqDNA聚合酶,反应体积为25μL;优化的PCR扩增程序为:94℃2 min;94℃1 min,退火1 min,72℃2 min,循环35次;72℃延伸10 min;退火温度根据引物温度设定。该IRAP体系分别用于‘元帅’和‘富士’的短枝和着色芽变指纹图谱的分析,构建的指纹图谱可以作为芽变鉴定的依据,表明这些突变可能系逆转座子转座插入或逆转座子间重组所致。

香菇反转录转座子间扩增多态性(IRAP)PCR反应体系的研究

为了开发香菇反转录转座子间扩增多态性标记(IRAP),建立稳定的IRAP-PCR反应体系,对影响IRAP-PCR的主要因素进行了优化筛选。确定了最佳反应体系为:20μl反应体系中,包含30ng模板DNA,0.30μmol/L引物,0.3mmol/L dNTPs,2.0mmol/L Mg2+及0.75UTaq酶。梯度PCR试验筛选得到的最佳退火温度为56.1℃。采用上述最佳反应体系和引物LTR1L-MarY1L对香菇18个菌株进行了IRAP-PCR扩增,验证了该体系的可靠性。

Genetic Polymorphism of Wheat by IRAP Analysis Based on Retrotransposon Wis2-1 A

[Objective] To analyze genetic polymorphism of different species of wheat. [Method] The DNA of young seedlings from 21 species of wheat was isolated,and their genetic polymorphism was analyzed by inter-retrotransposon amplified polymorphism （IRAP） using a molecule marker technology based on wheat retrotransposon Wis2-1 A. [Result] As shown by clustering map of the electrophoresis results,19 species of wheat assembled as cluster with different genetic distance. Most of the wheat species were distinguished. The genetic polymorphism among different species of wheat could be evaluated by this method objectively. [Conclusion] The analysis of IRAP based on wheat retrotransposon Wis2-1A could give a basis for breeding of wheat.

不同小麦品种遗传多态性研究——基于小麦反转录转座子Wis2-1A的IRAP分析

[目的]对不同小麦品种的遗传差异进行客观评估。[方法]提取21种小麦幼苗总DNA,利用基于小麦反转录转座子Wis2-1A的分子标记技术作IRAP分析,对其遗传多态性进行评价。[结果]电泳结果进行聚类分析,有19个品种聚成不同遗传距离的类群,绝大多数小麦品种得到了充分的区分,对不同品种的小麦遗传多样性进行了客观评价。[结论]基于小麦反转录转座子Wis2-1A的IRAP分析,可作为小麦育种判断遗传距离的依据。

中国水仙自然变异体的IRAP分析

以漳州水仙花主产区主栽品种"金盏"和"玉玲珑"为参照,利用IRAP标记技术对花变异体"金三角"及叶色变异体"金边水仙"进行变异分析.4对IRAP引物共获得177个位点,有123个多态性位点,4份中国水仙种质资源间的相似系数介于0.946-0.657之间.研究结果表明,变异体"金三角"和"金边水仙"与主栽品种"金盏"和"玉玲珑"的区别明显,转座插入和逆转座子间重组可能是引起中国水仙变异的重要机制之一.