健脾益气方干预内质网应激IRE1α-XBP1通路诱导腹膜间皮细胞自噬防治PF的机制

目的 研究健脾益气方通过干预腹膜透析(PD)大鼠内质网应激IRE1α-XBP1通路,诱导自噬以减轻腹膜间皮细胞(PMC)上皮间充质转化(EMT)的作用及机制。方法 SD大鼠72只,采用5/6肾切除联合腹膜透析液制备腹膜纤维化(PF)模型,随机分为假手术组、模型组、西药组、中药高、中、低剂量组,每组12只,进行28 d药物干预。苏木素-伊红(HE)染色观察腹膜组织形态学改变,免疫组化、Western印迹及RT-聚合酶链反应(PCR)测定IRE1α-XBP1通路自噬及纤维化标志蛋白表达。结果 与模型组比较,假手术组、西药组、中药高、中、低剂量组葡萄糖调节蛋白(GRP)78、XBP1s、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ、自噬相关蛋白Beclin-1、E-钙黏蛋白(cadherin)、α-肌动蛋白(SMA) mRNA及蛋白、pIRE1α蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 健脾益气方能够通过干预内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导PMC自噬,激活其适应性保护作用,达到减轻PMC的EMT、改善腹膜功能,最终起到拮抗PF作用。

酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路的影响

目的基于内质网应激(ERS)肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路探讨酸枣仁-合欢花对孤养结合慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠的干预作用。方法将144只大鼠随机分为正常组、模型组及酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组和文拉法辛组。除正常组外,其他各组进行21 d的孤养结合CUMS制备大鼠抑郁模型。用旷场实验和Morris水迷宫实验观察大鼠行为学变化;用透射电镜观察海马神经细胞超微结构变化;用TUNEL染色法观察海马神经细胞凋亡情况;用Western Blot法检测海马组织IRE1α、磷酸化(P)-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平;用Real-Time PCR法检测海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组旷场实验中水平运动和垂直运动得分下降(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少(P<0.01);海马神经细胞凋亡数增加(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平升高、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,酸枣仁-合欢花各组及文拉法辛组旷场实验中水平运动和垂直运动得分升高(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期缩短、跨越原平台次数增加(P<0.01);海马神经细胞凋亡数减少(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且酸枣仁-合欢花中剂量组较高、低剂量组效果更好。结论酸枣仁-合欢花可能通过调节内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路发挥抗抑郁作用。

IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46改善NK细胞杀伤功能清除HIV感染细胞的思路探析

自然杀伤细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,是抵御肿瘤和病毒感染的第一道防线。肿瘤或慢性病毒感染后,固有免疫NK细胞与适应性免疫T细胞共同发挥免疫功能对抗肿瘤及感染,但由于免疫系统无法迅速根除病灶,免疫细胞内质网稳态被打破,使其无法发挥正常的免疫杀伤及清除功能,导致病情迅速恶化甚至死亡。NKp46是仅表达在NK细胞上的特异性活化受体,它直接影响NK细胞的活化程度与杀伤作用的强弱。艾滋病是一种目前无法根治的慢性传染病之一,病毒持续感染引起NK细胞内质网应激,IRE1α/Xbp1s信号通路的启动导致NKp46蛋白翻译大部分被抑制,影响NK细胞活化发挥功能,因此基于IRE1α/Xbp1s靶向调控NKp46寻求改善NK细胞杀伤功能的新靶点成为研究的新思路。

基于IRE1/GPR78信号通路研究三黄益肾胶囊抑制DKD大鼠肾组织细胞凋亡的作用机制

[目的]探讨三黄益肾胶囊对糖尿病肾病(DKD)模型大鼠的治疗作用,同时研究三黄益肾胶囊对DKD模型大鼠肌醇酶1(IRE1)/G蛋白偶联受体78(GPR78)信号通路的影响。[方法]将30只大鼠平均分为正常组、模型组、阳性药组、三黄益肾低剂量及三黄益肾高剂量组,每组6只。除正常组外,其余各组运用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素(STZ)注射建立DKD模型,造模后正常组与模型组每天灌胃生理盐水,阳性药组每天灌胃厄贝沙坦11.51 mg/kg,三黄益肾低剂量及三黄益肾高剂量组每天分别灌胃三黄益肾胶囊0.81、1.62 g/kg,分别干预8周。通过观察给药期间各组大鼠血糖、体质量水平,检测造模给药后生化指标水平及肾组织病理学染色评估三黄益肾胶囊对DKD的治疗作用;其次,运用试剂盒及酶联免疫吸附(ELISA)法研究三黄益肾胶囊对DKD大鼠肾组织中氧化应激及炎症因子水平的影响;最后运用免疫荧光、Tunel染色、蛋白免疫印迹(Western blot)等方法研究三黄益肾胶囊对DKD大鼠肾组织细胞凋亡以及IRE1/GPR78信号通路的影响。[结果]经三黄益肾胶囊干预后,DKD大鼠体质量显著增加,血糖水平降低,血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及24 h尿蛋白水平下降,同时也可改善DKD大鼠肾组织病理学变化,肾组织炎细胞浸润及纤维化减轻。此外,三黄益肾胶囊可显著升高DKD模型大鼠肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性、降低丙二醛(MDA)水平,并降低DKD大鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。Western blot结果显示,三黄益肾胶囊显著降低了DKD模型大鼠肾组织中内质网应激标志性因子GRP78、IRE1蛋白表达水平,同时有效降低了模型大鼠肾组织中促凋亡蛋白BcL2关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的表达,提高了抑制凋亡蛋白BcL2的表达。[结论]三黄益肾胶囊对DKD模型大鼠具有显著治疗作用,其作用机制可能与抑制肾组织中IRE1/GPR78信号通路激活,改善内质网应激有关。

对药酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠行为学及内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路蛋白表达的影响

目的探讨对药酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠行为学及内质网应激(ERS)介导的肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路相关蛋白表达的影响。方法将72只健康的雄性SD大鼠随机分为六组:正常组、模型组、酸枣仁-合欢花组、文拉法辛组、酸枣仁-合欢花+salubrinal组及酸枣仁-合欢花+tunicamycin组,每组12只。采用孤养结合CUMS制备抑郁症模型。正常组和模型组不进行任何治疗。在造模的同时,酸枣仁-合欢花组和文拉法辛组开始给药。其中,酸枣仁-合欢花组给予8g·kg^(-1)的酸枣仁-合欢花悬浊液,而文拉法辛组则给予0.008g·kg^(-1)的文拉法辛。酸枣仁-合欢花+salubrinal组及酸枣仁-合欢花+tunicamycin组均在酸枣仁-合欢花组给药的基础上,于造模第19天开始腹腔注射1 mg·kg^(-1)的ERS抑制剂salubrinal或ERS诱导剂tunicamycin,持续3天。采用糖水偏爱实验、强迫游泳实验检测大鼠行为学改变;运用Western Blot法检测大鼠海马组织内磷酸化IRE1α(P-IRE1α)、磷酸化ASK1(P-ASK1)、磷酸化JNK(P-JNK)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白表达的变化;运用免疫组织化学法检测大鼠海马Bax、Bcl-2蛋白表达。结果相较于正常组,模型组大鼠的糖水消耗率显著降低,同时强迫游泳不动时间明显延长(P<0.01),海马P-IRE1α、P-ASK1、P-JNK、Bax蛋白表达水平增高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2/Bax比值明显减小(P<0.01);与模型组相比,酸枣仁-合欢花组、文拉法辛组及酸枣仁-合欢花+salubrinal组大鼠糖水消耗率明显增高、强迫游泳不动时间明显减少(P<0.01),海马P-IRE1α、P-ASK1、P-JNK、Bax蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平增高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值明显增大(P<0.01),且以酸枣仁-合欢花+salubrinal组的蛋白表达改善更为明显;与酸枣仁-合欢花组比较,酸枣仁-合欢花+tunicamycin组大鼠糖水消耗率明显下降、强迫游泳不动时间明显延长(P<0.01),海马P-IRE1α、P-ASK1、P-JNK、Bax蛋白表达水平增高(P<0.01),bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2/Bax比值明显减小(P<0.01)。结论对药酸枣仁-合欢花能够显著减少抑郁症模型大鼠的抑郁样表现,具有抗抑郁的功效,其作用机制可能是通过调节IRE1α/ASK1/JNK信号通路相关蛋白的表达来抑制ERS,从而减少ERS诱导的神经细胞凋亡,发挥抗抑郁效应。

益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征大鼠炎症反应的影响

目的探究益母草碱调节IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠炎症反应的影响。方法将大鼠随机分为空白组、模型组、益母草碱低剂量组、益母草碱高剂量组、联用HY-N2485组(高剂量益母草碱+NLRP3激活剂)。检测大鼠肺功能;血气分析仪检测氧分压(PaO_(2))和二氧化碳分压(PaCO_(2));ELISA法检测肺泡灌洗液白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;检测肺组织干湿比;检测肺组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性;HE染色观察大鼠肺组织病理形态;Western blotting检测肺组织中IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达。结果与空白组相比,模型组肺组织形态有明显损伤,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性降低,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,益母草碱低、高剂量组大鼠肺组织损伤明显减轻,PEF、FVC和FEV0.3/FVC水平、PaO_(2)、OI水平、肺泡灌洗液IL-10水平、肺组织CAT和SOD活性升高,PaCO_(2)水平、肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平、肺组织病理学评分、肺组织MDA含量、IRE1α、TXNIP、NLRP3、Caspase-1、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低(P<0.05);HY-N2485可减弱益母草碱对ARDS大鼠的改善作用(P<0.05)。结论益母草碱可降低ARDS大鼠炎症和氧化应激,减轻肺组织损伤,改善肺功能,可能与抑制IRE1α/TXNIP/NLRP3信号通路有关。

内质网应激IRE1α/XBP-1通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激1型跨膜蛋白激酶α(IRE1α)/X盒结合蛋白1(XBP-1)通路在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法利用内质网应激诱导剂Thapsigargin观察小鼠原代成纤维细胞中IRE1α/XBP-1通路活性。利用IRE1α抑制剂KIRA8探究IRE1α/XBP-1通路在原代中脑多巴胺能神经元变性死亡中作用。结果相比于未处理组细胞,Thapsigargin处理后原代成纤维细胞中内质网应激IRE1α/XBP-1通路明显上调。Thapsigargin处理可显著降低原代中脑多巴胺能神经元的存活率,而KIRA8处理可显著改善Thapsigargin导致的多巴胺能神经元存活率降低。结论内质网应激通过IRE1α/XBP-1通路介导多巴胺能神经元的变性死亡。

p-IRE1、β-catenin及XIAP在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床诊断及预后评估中的意义

目的探讨磷酸化需肌醇酶1蛋白(p-IRE1)、β-连环素(β-catenin)及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤(SNIP)中的表达及其在临床诊断和预后评估中的意义。方法选取2017年1月至2022年1月平顶山市第一人民医院收治的SNIP患者102例为SNIP组;另选取本院同时间段因鼻中隔偏曲对侧下鼻甲代偿性肥大而行下鼻甲黏膜部分切除术的患者99例,经病理确诊为正常鼻腔黏膜组织(设为对照组)。比较两组组织中p-IRE1、β-catenin及XIAP的表达强度情况;102例SNIP患者出院后,行2年门诊复查随访,比较SNIP组不同预后情况患者一般资料及p-IRE1、β-catenin及XIAP阳性表达;采用多元Logistic回归模型分析影响SNIP患者预后的危险因素。结果两组间p-IRE1、β-catenin及XIAP表达强度比较,差异具有统计学意义(P<0.05);且SNIP组p-IRE1、β-catenin及XIAP阳性率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。据随访统计,预后良好组81例,预后不良好组21例。两组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05);两组Krouse临床分期、病理分化程度、p-IRE1、β-catenin及XIAP阳性表达比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。多元Logistic回归模型结果显示,Krouse临床分期为T_3期-T_4期、病理分化程度伴恶变SNIP、p-IRE1、β-catenin及XIAP表达为阳性均是影响SNIP患者的预后不良的危险因素(P<0.05)。结论在SNIP组织中,p-IRE1、β-catenin及XIAP的表达强度及阳性表达率均显著高于正常鼻腔黏膜组织;通过检测上述指标阳性表达,可以预测SNIP预后情况,有利于SNIP后续治疗。

IRE1α和IRE1β在DSS诱导的小鼠慢性结肠炎中的表达及意义

目的探讨肌醇需求酶1(IRE1)α和IRE1β在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠慢性结肠炎中的表达及意义。方法选择8~10周龄的C57BL/6雌性小鼠随机分为两组:对照组10只,正常饮水;慢性炎症组10只,先给予1.0%DSS自由饮用7 d,然后正常饮水14 d如此作为一个周期,循环3个周期建立小鼠慢性结肠炎模型。通过疾病活动指数(DAI)评分、结肠长度测定和HE染色等方法评估肠道炎症程度。采用实时定量PCR技术检测小鼠结肠组织中炎症因子、内质网应激因子IRE1α、IRE1β、非剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1u)、剪接型X-盒结合蛋白1(XBP1s)和黏蛋白(MUC)2 mRNA表达,免疫组织化学方法检测IRE1α、IRE1β和MUC2表达。结果对照组小鼠无肠炎表现,而慢性炎症组在3个周期末结肠出现炎症表现。实时定量PCR结果显示白介素(IL)-6、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-αmRNA在慢性炎症组高于对照组(P<0.05);XBP1s和IRE1αmRNA在两组表达无明显差异;XBP1u mRNA在慢性炎症组表达低于对照组(P<0.05)。IRE1β和MUC2 mRNA在慢性炎症组表达均低于对照组(P<0.05)。IRE1α蛋白主要表达于结肠上皮的刷状缘、浆细胞等细胞的胞质中,其表达量在炎症组高于对照组,IRE1β蛋白和MUC2蛋白主要表达于结肠上皮细胞胞质中,两者表达量在炎症组低于对照组(P<0.05)。结论 IRE1α可能通过对XBP1进行剪接来参与肠道炎症反应,并且IRE1α还有可能通过其他机制来调节自身的表达来参与炎症过程;IRE1β和MUC2可能与结肠上皮的功能维持有关,在肠道炎症过程中IRE1β和MUC2表达功能受到抑制而影响炎症的发生和发展。

需肌醇酶1α及受其调控的依赖性衰减(IRE1α-RIDD)在免疫调节及自身免疫性疾病中的研究进展

内质网(ER)是蛋白质合成、折叠和修饰以及脂质合成和钙离子储存的重要细胞器。ER功能失调导致错误折叠或未折叠蛋白质在ER管腔中的积累,触发未折叠蛋白反应(UPR),需肌醇酶1α(IRE1α)是UPR分支中最保守的信号通路,切割编码转录因子XBP1的mRNA,导致XBP1剪接和激活。IRE1还通过受调控的IRE1依赖性衰减(RIDD)切割相关的mRNA或微小RNA(miRNA)。已有研究证明IRE1α-RIDD途径与免疫反应相关,但其信号级联与免疫协调的机制仍然不清楚,我们总结了IRE1α-RIDD对免疫细胞分化、成熟和免疫反应中细胞因子的表达等在免疫反应中的作用以及参与自身免疫性疾病的分子机制。

解毒通络调肝方对ZDF大鼠2型糖尿病动物模型胰腺组织IRE1/JNK通路相关蛋白表达的研究

目的：观察解毒通络调肝方对Purina#5008饲料饲养诱导ZDF大鼠2型糖尿病动物模型胰腺IRE1/pIRE1,JNK/PJNK蛋白表达的影响。方法：将以Purina#5008饲料饲养的SPF级雄性ZDF大鼠2型糖尿病动物模型分为模型组,盐酸二甲双胍组（0.5 g·kg-1·d-1）,解毒通络调肝方大剂量组（5 g·kg-1·d-1）、中剂量组（3 g·kg-1·d-1）、小剂量组（1 g·kg-1·d-1）;普通饲料饲养的SPF级雄性ZL大鼠作为正常组。盐酸二甲双胍组,解毒通络调肝方小、中、大剂量组均灌胃给药,正常组、模型组用等体积去离子水灌胃。饲养第17周处死大鼠无菌取胰腺组织,免疫组化技术观察内质网应激相关蛋白IRE1/p-IRE1,JNK/p-JNK的表达水平。结果：与正常组比较模型组、盐酸二甲双胍组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组胰岛细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK,PJNK蛋白表达增多（P〈0.05,P〈0.01）;与模型组比较盐酸二甲双胍组、解毒通络调肝方大、中、小剂量组胰岛细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK,P-JNK蛋白表达减少（P〈0.05,P〈0.01）;与盐酸二甲双胍组比较解毒通络调肝方大、中、小剂量组胰岛细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK,P-JNK蛋白表达减少（P〈0.05）;与解毒通络调肝方中剂量组比较大、小剂量组胰岛细胞胞浆中IRE1、P-IRE1、JNK,P-JNK蛋白表达减少。结论：以Purina#5008饲养诱导ZDF大鼠2型糖尿病动物模型可引起内质网应激,通过解毒通络调肝方干预,可减少IRE1、P-IRE1表达,同时降低JNK,P-JNK表达,其可能是防治2型糖尿病的机制及作用靶点之一。

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响

目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K。随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K。用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K。流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡。

基于内质网IRE1-JNK通路探讨萎胃颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

目的探讨萎胃颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜内质网IRE1-JNK通路的影响,以进一步了解其作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组及萎胃颗粒低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余组大鼠均采用综合法复制慢性萎缩性胃炎模型。造模成功后,正常组及模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃,西药组给予维酶素片混悬液灌胃,萎胃颗粒低、中、高剂量组分别给予相应剂量的萎胃颗粒煎液灌胃,均连续12周。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠胃黏膜组织中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显增高(P均<0.05);与模型组比较,各给药组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显降低(P均<0.05),且萎胃颗粒低、中、高剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值呈剂量依赖性降低,3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05);萎胃颗粒低剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值与西药组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),萎胃颗粒中、高剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显低于西药组(P均<0.05)。结论萎胃颗粒可以抑制大鼠胃黏膜IRE1-JNK通路的活化,降低IRE1、JNK磷酸化水平,减轻内质网应激引起的炎症反应,抑制慢性萎缩性胃炎向胃癌进一步转化。

夹脊电针对脊髓损伤大鼠内质网应激相关因子IRE1影响的实验研究

目的:探讨电针对脊髓损伤大鼠细胞凋亡及IRE1蛋白表达的影响。方法:健康雄性SD大鼠132只,随机分为假手术组、模型组、对照组(甲基强的松龙组)、疏波组;每组又分为8 h、3 d、7 d三个时相点。TUNEL原位末端标记法观察脊髓损伤后细胞凋亡情况,Western Blot法观察脊髓损伤后神经细胞内IRE1蛋白表达。结果:模型组及对照组TUNEL染色典型变化为凋亡细胞胞质浓缩,细胞核染色质固缩,呈斑块状聚集于核膜周围。相比对照组,疏波组细胞凋亡程度较轻。脊髓损伤后,IRE1蛋白表达明显上调。甲基强的松龙及电针干预后,各时相点两组IRE1蛋白表达均低于模型组;与对照组相比较,疏波组IRE1蛋白表达上调明显(P<0.05)。结论:电针可能通过降低IRE1的表达来降低脊髓损伤后继发性细胞凋亡,这可能是电针作用机制之一。

BiP调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应

正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response)。内质网应激条件下,内质网腔中的分子伴侣结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合从而帮助蛋白形成正确结构;同时未折叠蛋白通过与跨膜蛋白IRE1直接结合活化其内切核糖核酸酶结构域,活化的IRE1能够剪切Xbp1的mRNA使其形成有活性的转录因子进而起始分子伴侣与未折叠蛋白反应相关蛋白的表达使细胞脱离内质网应激状态。文章克隆了IRE1的启动子用荧光素酶报告基因法检测到BiP能够上调IRE1的启动子活性。通过构建IRE1启动子一系列截短体的报告基因载体确定了IRE1启动子活性的核心区域进一步通过逆转录PCR和免疫印迹在mRNA水平和蛋白水平分别检测BiP对IRE1启动子的调控作用。结果发现在内质网应激条件下分子伴侣BiP通过上调IRE1启动子转录活性增加IRE1的表达进而提高细胞处理内质网应激时未折叠蛋白的能力为揭示内质网应激条件下BiP调控IRE1转录调控机制提供理论依据,同时为阐明ER stress各信号分子之间的作用机制奠定实验基础。

siIRE1α重组腺病毒对内质网应激介导凋亡的影响

目的构建内质网跨膜蛋白肌醇酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒,并探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)状态下其对C2C12细胞增殖凋亡的影响。方法人工合成靶向IRE1α的siRNA序列,连接到穿梭载体pSES-HUS上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183感受态中进行同源重组,得到pAdSES-HUS-IRE1αsiRNA重组质粒。通过脂质体介导在HEK293细胞中包装并扩增重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA,在C2C12细胞中采用RT-PCR和Western blot检测其干扰效果,并通过FCM法和MTT检测Tm诱导ERS时病毒对C2C12细胞增殖凋亡的影响(分为4组:NC组、Tm单独处理组、Tm+Ad-RFP组和Tm+AdIRE1αsiRNA组),Western blot检测C2C12细胞中Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达。结果成功获得了病毒滴度约为4.3×1011PFU/mL的重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA。RT-PCR和Western blot检测结果表明,该重组腺病毒有效地抑制了C2C12细胞中IRE1α的表达。FCM检测结果表明,ERS条件下,Tm+Ad-IRE1αsiRNA组S期的细胞比例分别比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组升高12.62%和14.80%(P<0.05);凋亡率比Tm单独处理组和Tm+Ad-RFP组降低16.64%和16.26%(P<0.05)。MTT实验结果与Cleaved Caspase-3和Chop蛋白的表达与FCM结果一致。结论重组腺病毒Ad-IRE1αsiRNA在C2C12细胞中能有效抑制IRE1α的表达;ERS状态下,RNA干扰IRE1α基因可促进C2C12细胞的增殖,抑制其凋亡。

IRE1α促进人牙周膜成纤维细胞增殖

目的研究内质网跨膜蛋白IRE1α对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)增殖的影响。方法将成功构建的人IRE1α基因重组质粒染入hPDLFs细胞,采用免疫印迹法检测IRE1α重组基因在真核细胞内的表达情况,XTT法和流式细胞仪(FCM)检测转染后hPDLFs细胞增殖和细胞周期变化。结果酶切及测序结果证实IRE1α重组质粒构建成功;免疫印迹分析结果证实,IRE1α重组质粒能在hPDLFs细胞内正确表达;在内质网应激(ERS)状态下,与衣霉素(tunicamycin,TM)对照组相比,XTT检测结果显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞增殖率明显增高(P<0.01);FCM结果分析显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞S期比例增加而G1期减少(P<0.05)。结论在ERS状态下,IRE1α促进hPDLFs细胞增殖,促进hPDLFs细胞从G1期进入S期。

内质网应激反应时IRE1-依赖性XBP1剪接机制

在哺乳动物细胞,X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)是一种具有重要作用的蛋白质。哺乳动物细胞中,当未折叠蛋白质在内质网蓄积时会激活一种细胞内信号转导系统,即未折叠蛋白质反应(UPR)。哺乳动物细胞定位于内质网膜的IRE1α,可通过二聚化而激活其自身的蛋白激酶及核糖核酸酶活性,从而部分地转导UPR信号。活化的IRE1α在XBP1 mRNA的两个位点对其进行切割反应,诱导一种非传统剪接反应。这种剪接反应会产生一种功能性XBP1转录因子,可作为内质网应激反应时的传感器。同时,在内质网应激反应时还有另一种转录激活因子6(ATF6)蛋白酶解系统发挥作用。

醒鼻凝胶滴鼻剂对变应性鼻炎豚鼠Periostin、IRE1α及嗅区鼻黏膜形态学的影响

观察醒鼻凝胶滴鼻剂对AR(变应性鼻炎,allergic rhinitis)豚鼠鼻黏膜及血清Periostin(骨膜素,Pn)、IRE1α(内质网感应蛋白肌醇需求酶,1α)的影响,扫描电镜观察其对嗅区鼻黏膜形态学的影响,联合血清Ig E(免疫球蛋白E,immunoglobulin E)及变应性鼻炎豚鼠行为学评分,进行醒鼻凝胶滴鼻剂的机制研究。健康普通级豚鼠70只,OVA(卵清蛋白,Ovalbumin)致敏建立变应性鼻炎豚鼠模型,随机分为完全空白对照组;生理盐水模型组;生理盐水给药模型组,醒鼻凝胶滴鼻剂低、中、高剂量组,雷诺考特组,10只/组。观察各组行为学变化,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清Periostin、Ig E、IRE1α;逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测鼻黏膜Periostin、IRE1αm RNA,扫描电镜观察嗅区鼻黏膜形态。结果显示:AR豚鼠模型构建成功;OVA模型组鼻黏膜Periostin m RNA表达上升(P <0. 05),鼻黏膜IRE1αm RNA及血清Periostin、IRE1α、Ig E表达也均上升(P <0. 01);高剂量醒鼻凝胶滴鼻剂给药后鼻黏膜及血清中Periostin、IRE1α、Ig E表达均显著下调(P <0. 01);OVA模型组嗅区黏膜细胞管腔萎缩,脱落、变稀,排列紊乱,组织表面粘连,见较多分泌物附着;醒鼻凝胶滴鼻剂干预后嗅区鼻黏膜细胞管腔再生,排列较整齐,分泌物减少。醒鼻凝胶滴鼻剂可下调鼻黏膜及血清Periostin、IRE1α的表达,影响血清Ig E,并能减轻炎症分泌物,促进变应性鼻炎豚鼠嗅区鼻黏膜细胞管腔再生,发挥治疗变应性鼻炎的作用,且存在一定浓度依赖,高浓度药效更佳。

IRE1α调控CD155表达影响NK细胞对结肠癌细胞的杀伤敏感性

目的:探讨肌醇的跨膜激酶/核酸内切酶1α(inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease 1α,IRE1α)调控CD155表达对自然杀伤(nature killer,NK)细胞杀伤结肠癌细胞作用的影响。方法:免疫组织化学法检测结肠癌组织及癌旁组织中IRE1α的表达;qRT-PCR与Western blot检测IRE1α与CD155的mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测人外周血CD3^(-)CD56^(+)NK细胞百分比及与其纯度和NK细胞表面T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)的表达;乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对结肠癌细胞的杀伤率。结果:IRE1α在结肠癌组织和细胞中的表达高于癌旁组织及人正常结肠上皮细胞;结肠癌患者外周血CD3^(-)CD56^(+)NK细胞百分比低于健康者。si-IRE1α组结肠癌细胞的IRE1α表达水平低于si-NC组(P<0.05),CD155表达水平高于si-NC组(P<0.05),NK细胞对si-IRE1α组结肠癌细胞的杀伤率高于si-NC组的杀伤率(P<0.05),NK细胞对si-IRE1α+TIGIT-mcAb组结肠癌细胞的杀伤率高于si-IRE1α组的杀伤率(P<0.05)。Pc-IRE1α组结肠癌细胞的IRE1α表达水平高于Pc组(P<0.05),CD155表达水平低于Pc组(P<0.05),NK细胞对Pc-IRE1α组结肠癌细胞的杀伤率低于Pc组的杀伤率(P<0.05)。Pc-IRE1α+si-CD155组结肠癌细胞CD155表达水平高于Pc-IRE1α+si-NC组(P<0.05),NK细胞对Pc-IRE1α+si-CD155组结肠癌细胞的杀伤率高于Pc-IRE1α+si-NC组(P<0.05),NK细胞对Pc-IRE1α+si-CD155+TIGIT-mcAb组细胞的杀伤率高于Pc-IRE1α+si-CD155组(P<0.05)。结论:结肠癌组织和细胞中IRE1α高表达,IRE1α负调控结肠癌细胞CD155的表达,影响NK细胞对结肠癌细胞的杀伤敏感性。