基于ROS-ASK1-JNK/NF-κB通路探讨三才连梅颗粒调控2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝肝细胞凋亡水平的研究

目的探讨三才连梅颗粒对2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)合并非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝细胞凋亡的作用及机制。方法以高脂高糖+链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病合并脂肪肝SD大鼠为模型,三才连梅颗粒进行干预,实验结束对各组大鼠进行腹腔葡萄糖耐量实验;ELISA法检测各组大鼠血清中生化及肝脏匀浆中炎症水平;测定肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平反应氧化应激情况;Real-time PCR检测肝脏组织凋亡信号调节激酶1(ASK1)、氨基末端激酶(c-Jun,JNK)、核因子-κB(NF-κB)mRNA的表达;Western blot检测肝脏凋亡蛋白的表达及TUNEL法检测肝细胞凋亡情况;苏木素伊红(HE)染色观察肝脏病理组织结构。结果三才连梅颗粒能减轻T2DM合并NAFLD模型大鼠的体质量,降低血清血糖、胰岛素水平;降低肝脏匀浆白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,改善胰岛素抵抗、血脂代谢紊乱及氧化应激,减轻肝细胞脂肪变性。三才连梅颗粒可下调T2DM合并NAFLD模型大鼠肝脏组织ASK1、JNK、NF-κB mRNA表达,调节凋亡相关蛋白Bax、caspase-3、Bcl-2的表达以减轻肝细胞凋亡情况。结论本研究证明三才连梅颗粒可以通过抑制ROS-ASK1-JNK/NF-κB信号通路,调节细胞凋亡而改善肝脏胰岛素抵抗及氧化应激,延缓或逆转NAFLD病程进展。

比索洛尔通过ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路改善缺血再灌注诱导的H9C2心肌细胞损伤的研究

目的:探讨比索洛尔对缺血再灌注(I/R)诱导的H9C2心肌细胞损伤的影响及其作用机制。方法:体外培养H9C2心肌细胞,将H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、缺氧/复氧(H/R)模型组(Model组)、比索洛尔组(Bisoprolol组)、比索洛尔+凋亡信号调节激酶1(ASK1)重组蛋白组(Bisoprolol+ASK1组)。除Control组外,其余各组H9C2心肌细胞均进行H/R损伤处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测细胞活力;采用流失细胞术检测细胞凋亡;采用酶联免疫吸附试验检测细胞中心肌损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)]和炎症因子[白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;采用激光共聚焦检测细胞中钙离子浓度;采用蛋白质印迹法检测细胞中ASK1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38丝分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,Model组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Model组比较,Bisoprolol组和Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均升高,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与Bisoprolol组比较,Bisoprolol+ASK1组H9C2细胞活力、LDH和cTnT水平均降低,细胞凋亡率、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,细胞内钙离子浓度、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:比索洛尔能够通过抑制炎症反应和钙超载,改善I/R诱导的H9C2心肌细胞损伤,其作用机制可能与抑制ASK1-JNK/p38 MAPK信号通路激活有关。

刺甘草查尔酮下调ASK1-JNK信号通路抗FFA诱导的非酒精性脂肪性肝病

目的探究刺甘草查尔酮(echinatin,Ech)对游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)诱导人肝癌(HepG2)细胞的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型的影响及作用机制。方法实验分组为对照组、FFA模型组、Ech组(0.3、1、3μmol·L^(-1));通过细胞形态学和化学荧光法分析细胞内脂质积累、线粒体损伤、氧化应激以及凋亡情况;分子对接预测Ech与ASK1和JNK蛋白的亲和力;Western blot分析NF-κB p65、BAX以及ASK1-JNK信号通路相关蛋白表达情况。结果相较于FFA模型组,Ech组细胞脂质积累明显减轻,线粒体损伤以及氧化应激情况得到改善,凋亡率明显下降,并且NF-κB p65、BAX、p-ASK1、JNK、p-JNK的蛋白表达量均明显降低。结论Ech改善FFA诱导的HepG2细胞脂质积累、线粒体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡以及炎症反应,可能与下调ASK1-JNK信号通路有关。

当归补血汤对糖尿病大鼠肾组织内质网IRE1α-JNK通路的抑制作用

目的：为了研究当归补血汤对糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）大鼠肾组织内质网应激通路IRE1α-JNK的作用机制及其对高糖下肾脏组织的保护作用。方法：链脲佐菌素（STZ）联合高脂饲料,建立糖尿病肾病动物模型,分为：正常对照组（N）、糖尿病肾病对照组（DN）、格列奇特组（GT）、当归补血汤低剂量组（DL）、当归补血汤高剂量组（DH）。对照组（N、DN）以生理盐水灌胃,治疗组分别以格列齐特缓释片溶液、高低浓度当归补血汤浓缩液灌胃处理8周后取材,用酶偶联比色法检测相关生化指标（血糖、血脂及肾功能指标）,光镜下观察肾脏病理改变;West Blog、RT-PCR检测IRE1α、JNK蛋白的表达,TUNEL法测定各组肾脏组织细胞的凋亡。结果：结果显示,DN组大鼠空腹血糖、血生化指标较N组明显升高;肾组织中p-IRE1α,p-JNK蛋白表达量较对照组N明显增加,细胞凋亡程度高;治疗组血糖、血脂、血肌酐等指标均低于DN组;肾脏p-IRE1α,pJNK蛋白表达较DN组下降;肾脏组织中细胞凋亡较DN组改善,N组与DH组无明显差异（P〉0.05）。结论：研究表明当归补血汤可以抑制高糖下肾组织IRE1α-JNK通路的表达,减轻高糖下肾脏的内质网应激反应,从而保护肾组织。

基于内质网IRE1-JNK通路探讨萎胃颗粒治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

目的探讨萎胃颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜内质网IRE1-JNK通路的影响,以进一步了解其作用机制。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、西药组及萎胃颗粒低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外,其余组大鼠均采用综合法复制慢性萎缩性胃炎模型。造模成功后,正常组及模型组给予0.9%氯化钠注射液灌胃,西药组给予维酶素片混悬液灌胃,萎胃颗粒低、中、高剂量组分别给予相应剂量的萎胃颗粒煎液灌胃,均连续12周。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠胃黏膜组织中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显增高(P均<0.05);与模型组比较,各给药组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显降低(P均<0.05),且萎胃颗粒低、中、高剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值呈剂量依赖性降低,3组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05);萎胃颗粒低剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值与西药组比较差异均无统计学意义(P均>0.05),萎胃颗粒中、高剂量组胃黏膜细胞胞浆中IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK蛋白表达OD值均明显低于西药组(P均<0.05)。结论萎胃颗粒可以抑制大鼠胃黏膜IRE1-JNK通路的活化,降低IRE1、JNK磷酸化水平,减轻内质网应激引起的炎症反应,抑制慢性萎缩性胃炎向胃癌进一步转化。

苏木乙酸乙酯提取液对动脉粥样硬化小鼠ASK1-JNK信号通路及胶原蛋白水平的影响

目的观察苏木乙酸乙酯提取液(SAEE)对动脉粥样硬化模型小鼠ASK1-JNK信号通路及胶原蛋白表达的影响。方法 50只10周龄雄性载脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠随机分为空白对照组、模型组、SAEE低剂量组、SAEE中剂量组和SAEE高剂量组。除空白对照组,其他组小鼠均采用高脂饮食喂养的方式造模。造模后药物组给予相应剂量的SAEE灌胃治疗,空白对照组、模型组给予等容积的蒸馏水灌胃。实验结束后收集标本,ELISA法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TAG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平,Western blotting和RT-PCR法检测TNF-α、p-ASK1、ASK1、pJNK、JNK、脯氨酰-4-羟化酶(P4H)、Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)及Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)蛋白及m RNA的表达。结果与空白组比较,模型组小鼠TC、TAG、LDL、TNF-α、p-ASK1、p-JNK的水平显著升高,HDL、P4H、COL-I、COL-Ⅲ的水平和COL-I/COL-Ⅲ的比值显著降低,差异均具有统计学意义(P <0.01)。与模型组比较,SAEE能显著抑制小鼠TC、TAG、LDL、TNF-α、p-ASK1、p-JNK的水平,升高HDL、P4H、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的水平和COL-Ⅰ/COL-Ⅲ的比值,差异均具有统计学意义(P <0.01);在SAEE各剂量组中,以SAEE高剂量组疗效最佳。结论SAEE能够通过抑制炎症反应和ASK1-JNK信号通路的活化,达到调控血脂和稳定斑块的目的。

复方丹参滴丸通过调控IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路降低内质网应激和自噬保护血管平滑肌细胞

目的探讨复方丹参滴丸通过调控内质网应激和自噬保护血管平滑肌细胞的分子机制。方法50例动脉粥样硬化患者随机分为两组,一组正常治疗,另一组加入复方丹参滴丸并进行临床疗效观察。将血管平滑肌细胞分为对照组、ox-LDL模型组、复方丹参滴丸组、复方丹参滴丸+内质网应激抑制剂组、复方丹参滴丸+内质网应激诱导剂组。检测增殖情况,测定各组血管细胞舒张功能因子与氧化应激情况,分别检测内质网应激标志蛋白,自噬标志蛋白及凋亡相关蛋白表达情况,并检测IRE1-TRAF2-ASK1-JNK信号通路的激活情况。结果与对照组相比,ox-LDL模型组细胞的各项指标显示其处于内质网应激、高氧化应激、高自噬状态,并且发现IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路被过度激活。而与ox-LDL模型组相比,复方丹参滴丸组和复方丹参滴丸+内质网应激抑制剂组的上述指标均明显好转,IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路被过度激活得到改善,且内质网应激抑制剂更为明显,复方丹参滴丸+内质网应激诱导剂组则明显逆转了复方丹参滴丸的好转。结论复方丹参滴丸通过抑制IRE1-TRAF2-ASK1-JNK通路的过度激活,降低内质网应激,维持适当自噬,抑制细胞异常增殖和凋亡,从而保护血管平滑肌细胞。

福瑞替尼对三阴性乳腺癌血管生成、肿瘤生长及IRE1-ASK1-JNK通路的影响

目的探讨福瑞替尼对三阴性乳腺癌血管生成、肿瘤生长及跨膜蛋白肌醇需求酶1(IRE1)-细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)-c-Jun氨基端激酶(JNK)通路的影响。方法取三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231,将其分为生理盐水(NS)组、低剂量福瑞替尼(LD)组、中剂量福瑞替尼(MD)组、高剂量福瑞替尼(HD)组,NS组加入100μmol/L的生理盐水,LD组、MD组、HD组分别加入25、50、100μmol/L的福瑞替尼。MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,细胞三维培养观察细胞形成拟态血管能力,蛋白质印迹法检测血管生成及IRE1-ASK1-JNK通路相关指标。将20只三阴性乳腺癌大鼠模型采用随机数字表法分为对照组、实验组,每组10只,对照组给予生理盐水灌胃,实验组给予100μmol/L福瑞替尼灌胃,观察并记录两组大鼠肿瘤瘤体生长情况。结果NS组、LD组、MD组、HD组的48 h细胞增殖率分别为(85.44±5.58)%、(73.24±4.95)%、(61.53±4.07)%、(50.23±2.97)%(F=4.01,P=0.002),与NS组相比,LD组、MD组、HD组细胞增殖率显著降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05);NS组、LD组、MD组、HD组的细胞凋亡率分别为(3.41±0.39)%、(18.75±1.94)%、(24.97±2.58)%、(38.62±3.27)%(F=18.99,P<0.001),与NS组相比,LD组、MD组、HD组细胞凋亡率显著升高,且呈剂量依赖性(均P<0.05);NS组、LD组、MD组、HD组的拟态血管数目分别为19.58±2.11、15.67±2.02、11.57±1.73、5.20±1.23(F=3.28,P=0.008),与NS组相比,LD组、MD组、HD组拟态血管数目显著降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05);NS组、LD组、MD组、HD组的血管内皮生长因子(VEGF)蛋白相对表达量分别为2.36±0.21、1.79±0.17、1.48±0.14、0.94±0.10(F=5.17,P<0.001),IRE1蛋白相对表达量分别为1.18±0.12、1.67±0.18、2.03±0.24、2.39±0.28(F=5.55,P<0.001),ASK1蛋白相对表达量分别为1.09±0.11、1.46±0.13、1.81±0.18、2.33±0.21(F=5.32,P<0.001),JNK蛋白表达分别为1.01±0.09、1.48±0.14、1.86±0.21、2.28±0.24(F=6.92,P<0.001),与NS组相比,LD组、MD组、HD组细胞VEGF蛋白表达显著降低,IRE1、ASK1、JNK蛋白表达显著升高,且呈剂量依赖性(均P<0.05);与对照组相比,实验组瘤体质量、体积明显降低[(0.55±0.10)g比(1.37±0.15)g,t=14.38,P<0.001;(77.39±3.21)mm3比(118.26±5.34)mm3,t=20.74,P<0.001],抑瘤率显著升高[(71.23±3.85)%比(32.56±3.08)%,t=24.80,P<0.001]。结论福瑞替尼对三阴性乳腺癌细胞活性具有抑制作用,可显著减少其血管生成,抑制肿瘤生长,可能与激活IRE1-ASK1-JNK通路相关。

白花蛇舌草通过抑制RAP1-JNK信号通路选择性促进人肾癌ACHN细胞间质-上皮转化

目的 :研究白花蛇舌草(Hedyotis di usa Willd,HDW)对人肾癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制。方法 :人肾细胞腺癌ACHN和人肾近曲小管HK-2细胞经HDW处理24 h后,采用CCK-8法检测HDW对ACHN和HK-2细胞增殖的影响,FCM法检测HDW对细胞周期和凋亡的影响。光学显微镜下及罗丹明染色法观察HDW处理对ACHN和HK-2细胞形态的影响;采用免疫荧光染色法和蛋白质印迹法检测间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)相关蛋白表达的变化。划痕愈合实验和Transwell小室法检测ACHN和HK-2细胞的迁移和侵袭能力,RNA测序法检测HDW对ACHN细胞转录组的影响;实时荧光定量PCR法检测RAP1信号通路相关基因RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phospho-JNK,p-JNK)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化ERK(phospho-ERK,p-ERK)表达水平的改变。结果:HDW可选择性抑制ACHN细胞增殖(P <0.01),将细胞周期阻滞于S期(P <0.01),诱导细胞凋亡(P <0.01)。HDW处理后ACHN细胞的形态发生了明显变化,HDW可促进ACHN细胞中E-钙黏蛋白1(E-cadherin 1)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达,并抑制波形蛋白(Vimentin)和Snail1的表达(P值均<0.01)。HDW能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P值均<0.01),且ACHN和HK-2细胞之间没有明显差异。RNA测序结果分析显示,HDW可影响细胞周期相关基因以及控制细胞生长的转录因子E2F和Myc靶基因的表达,并激活p53信号通路;HDW可显著下调ACHN细胞中RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA(P值均<0.000 1)和p-JNK蛋白的表达水平。结论 :HDW可能通过抑制RAP1-JNK信号通路来选择性抑制肾癌细胞ACHN的增殖,促进ACHN细胞MET、周期阻滞和凋亡。

电针通过调节海马IRE1α-JNK通路相关蛋白改善糖尿病模型小鼠的认知障碍

目的:观察电针对糖尿病模型小鼠认知障碍及肌醇依赖酶1α(IRE1α)-c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路相关蛋白的影响,探讨其作用机制。方法:经Morris水迷宫实验筛选出30只成模的db/db小鼠,随机分为电针组与模型组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组。电针组针刺双侧“肺俞”“脾俞”“肾俞”“合谷”“后三里”“三阴交”“太冲”及“百会”“神庭”,“百会”“神庭”连接1对电极,同侧的“脾俞”“肾俞”连接1对电极,“三阴交”“后三里”连接1对电极,20 min/次,1次/d,干预6 d,休息1 d,连续治疗4周。记录各组小鼠每天摄食量、饮水量及每周的体质量、血糖;Morris水迷宫实验检测小鼠学习及记忆能力;HE染色法观察小鼠海马CA1区细胞形态;Western blot法检测小鼠海马IRE1α、JNK、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组精神萎靡、反应迟钝,摄食量、饮水量明显增多(P<0.01),体质量、血糖明显升高(P<0.01),逃避潜伏期明显延长(P<0.05),穿越原平台次数明显减少(P<0.01),海马CA1区细胞排列混乱,细胞核不清,空泡现象明显,海马组织中IRE1α、JNK蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组反应灵敏、活泼好动,摄食量、摄水量明显减少(P<0.01),体质量、血糖明显降低(P<0.05,P<0.01),逃避潜伏期缩短(P<0.05),穿越原平台次数增多(P<0.05),海马CA1区细胞形态改善明显,海马组织中IRE1α、JNK蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:电针可改善db/db小鼠认知障碍,调节体质量、血糖,改善海马组织细胞形态,其机制可能是通过调节IRE1α-JNK通路及相关蛋白来实现的。

小檗胺对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其机制研究

目的研究小檗胺体外对人肺腺癌A549细胞凋亡及TNF-α-JNK信号通路的影响。方法 MTT比色法检测小檗胺对A549细胞增殖的影响;显微镜观察A549细胞形态变化;Annexin V/PI双标法检测细胞的凋亡率;Western blotting法检测细胞凋亡标记蛋白Bcl-x、Caspase-3和PARP表达的变化,c-jun氨基末端激酶(JNK)的蛋白表达及其磷酸化表达水平;荧光定量PCR和ELISA检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的变化;通过JNK通路抑制剂进一步验证TNF-α-JNK信号通路在小檗胺药效中的作用。结果小檗胺能够显著抑制A549细胞增殖,并呈浓度相关性,小檗胺给药后24 h的IC50值为9.01μmol/L;经小檗胺处理后,A549细胞可见典型的凋亡形态学改变,Annexin V/PI双标法检测结果也显示小檗胺可诱导A549细胞凋亡,小檗胺10μmol/L组细胞早期凋亡率为13.8%,为对照组的6.6倍;小檗胺可显著降低抗凋亡蛋白Bcl-x的表达,明显增强促凋亡蛋白Caspase-3和PARP的活性,显著提高TNF-α基因和蛋白表达及JNK蛋白的磷酸化表达水平,激活TNF-α-JNK通路。结论小檗胺能抑制A549细胞的增殖,诱导其凋亡,其作用机制可能与TNF-α-JNK信号通路的激活有关。