HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)对Ⅰ型干扰素表达的影响,并进一步探讨相关机制。方法:以HepG2细胞和稳转HBV基因组的HepG2.2.15细胞为模型,转染针对乙型肝炎病毒X(HBx)基因的小干扰RNA(siRNA)[HBx-siRNA]至HepG2.2.15细胞,转染HBx蛋白表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,荧光定量PCR技术分析各细胞中的IFN-α、IFN-β mRNA含量,荧光显微镜观察HepG2细胞内质粒pEGFP-HBx的表达,Western blot技术分析各细胞中HBx和p-IRF3蛋白含量变化,以探讨HBV通过HBx蛋白对Ⅰ型干扰素表达的影响。结果:IFN-α和IFN-β mRNA在HepG2.2.15细胞中的含量略高于HepG2细胞,差异无统计学意义(P>0.05);RNA干扰抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达后,细胞中IFN-α、IFN-β mRNA含量显著升高,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞中Ⅰ型干扰素的基因表达量和p-IRF3的蛋白表达量均降低。结论:HBV通过HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化,从而抑制Ⅰ型干扰素的表达。

14-3-3η抑制TRIF和IKKε激活的IRF3的转录活性

为了研究14-3-3蛋白是否参与了IRF3信号通路,以及14-3-3蛋白质对IRF3转录活性的影响,在真核细胞293T中表达14-3-3蛋白质的三种亚型,并且通过双荧光报告系统研究14-3-3蛋白对TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性的影响。结果显示14-3-3蛋白质能够在真核细胞293T中正确表达,过表达14-3-3η能够抑制TRIF和IKKε激活的IRF3转录活性,而且能够直接抑制IRF3转录活性。

柯萨奇病毒A组16型的3C蛋白抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导

目的探讨柯萨奇病毒A组16型对RIG-Ⅰ介导的信号通路的影响。方法将带有IFN-β启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞,之后用CA16感染细胞,24 h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞,在感染6 h、12 h、24 h以及48 h后用Real-time PCR方法测定细胞中IFN-β的mRNA的表达水平。将pIFN-β-luc和pRL-CMV以及表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后检测报告基因活性。将带有绿色荧光蛋白GFP的IRF3质粒和表达RIG-I基因N端质粒以及表达CA16的3C蛋白共转染细胞,24 h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质间相互作用。结果 CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调,CA16的3C蛋白抑制了RIG-I诱导的IFN-β的启动子活性以及IRF3的核迁移,CA16的3C蛋白与RIG-Ⅰ存在相互作用。结论 CA16的3C蛋白通过与RIG-Ⅰ相互作用从而抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导。

METTL3抑制抗病毒先天免疫信号转导

目的进一步探究甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)对抗病毒先天免疫信号转导过程的影响。方法在HEK293T细胞中过表达以及敲低METTL3,利用不同的病毒感染细胞后,通过免疫印迹法检测Ⅰ型干扰素信号通路中上游激酶TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)以及下游转录因子干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和核因子κB(NF-κB)p65亚基活化情况,水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)复制标志分子VSV-G表达水平。通过尾静脉注射VSV建立小鼠感染模型,观察Mettl3敲除小鼠(Mettl3^(F/F;Mx1-Cre))和对照小鼠(Mettl3^(F/F))生存率以及肝系数和肺系数的变化情况;通过ELISA检测小鼠血清Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β的产生情况。结果HEK293T细胞中过表达METTL3后TBK1、p65以及IRF3的磷酸化减弱,VSV-G的表达下降。小鼠VSV感染模型中,Mettl3^(F/F;Mx1-Cre)小鼠死亡率明显降低,肝系数下降,且血清中IFN-α和IFN-β的含量明显上升。结论过表达METTL3抑制TBK1-IRF3信号通路的激活,促进VSV的复制;在Ⅰ型干扰素反应性细胞中敲除Mettl3后,小鼠对VSV的抵抗力增强。METTL3作为一个负调控因子,抑制抗病毒先天免疫信号转导。

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly(I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDVM蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。

转录因子核因子κB和IKK在慢加急性肝衰竭中的临床诊断价值

目的探讨在STING-IRF3通路中转录因子核因子κB和IKK在慢加急性肝衰竭(ACLF)中的表达及其与患者临床特征和预后的相关性。方法将2014年3月至2018年11月于辽宁中医药大学附属医院就诊的144例ACLF患者作为研究对象,收集患者的血液、尿液与术后切除的肝部样本作为试验组,同时选取144例正常人的血液、尿液与肝部组织作为对照组,采用蛋白质免疫印迹法检测不同样本中核因子κB和IKK蛋白表达量与磷酸化水平变化情况,以及其与患者临床特征和预后的相关性。结果核因子κB蛋白在患者的肝部、血液与尿液中的表达量不变(P>0.05),而磷酸化水平明显升高(P<0.05);IKK蛋白在患者的肝部、血液以及尿液中的蛋白表达量与磷酸化蛋白表达量显著升高(P<0.05);核因子κB和IKK蛋白表达均为阳性的患者,其4年的生存率为5.89%;核因子κB蛋白表达为阳性,IKK蛋白表达为阴性的患者,其4年的生存率为20.12%;核因子κB蛋白表达为阴性,IKK蛋白表达为阳性的患者,其4年的生存率为25.18%。结论STING-IRF3通路中转录因子核因子κB和IKK对ACLF具有正向调控作用。

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P<0.01或P<0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P<0.01或P<0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P<0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。