基于CRISPR/Cas9技术构建犬IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除的MDCK细胞系

由干扰素诱导细胞产生的GTP蛋白酶M(IRGMs)在抵御病原微生物中发挥着核心作用。为建立IRGMs基因缺失的MDCK细胞系,本研究利用CRISPR/Cas9技术根据MDCK中IRGM4、IRGM5和IRGM6的基因序列设计并合成正链和负链引导RNA(gRNA)的靶DNA序列,以本实验室构建的含有单链引导RNA(sgRNA)骨架转录序列的通用质粒(p Gen-sgRNA)为模板,将U6启动子与合成的相关基因gRNA靶序列经PCR融合扩增,其产物再与sgRNA的骨架转录序列进行重叠延伸PCR扩增,并将扩增产物克隆于p GEM-T载体中,分别构建了具有靶向不同目的基因ORF的gRNA重组质粒。将这些重组质粒分别与pMJ920质粒共转染于MDCK细胞中,通过G418筛选和流式细胞仪分选,并以终点稀释法纯化培养筛选出的单细胞克隆株。经gRNA靶序列片段的测序鉴定,获得了目的基因敲除的MDCK细胞系,并分别命名为MDCK-IRGM4-、MDCK-IRGM5-和MDCKIRGM6-。通过western blot检测经γ干扰素诱导条件下的这3种IRGMs基因在敲除细胞系中相应的蛋白表达均为阴性。这3种MDCK细胞IRGMs敲除的细胞系的建立,为进一步研究IRGMs基因在抗细胞内病原微生物感染中的功能奠定了基础。

IRGM基因多态性与社区获得性肺炎易感性研究

目的:分析湖北地区人群免疫相关基因IRGM启动子区多态性与社区获得性肺炎(CAP)易感性的相关性。方法:以100例CAP患者为病例组,依据病情严重程度分为重症肺炎组(SCAP组,n=35)和非重症肺炎组(NSCAP=65),80例健康者为对照组。采用一代测序技术对所有对象的IRGM基因3个SNP位点(rs4958842、rs4958843、rs4958846)进行检测,并分析IRGM各位点基因型、等位基因和单体型与CAP易感性的相关性。结果:病例组rs4958843位点TT基因型及T等位基因的分布频率高于对照组(P<0.05),且携带rs4958843突变型的患者WBC和CRP较野生型的携带者高(P<0.05);rs4958842和rs4958846位点的基因型和等位基因在病例组与对照组中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。以上3个位点的基因型与等位基因在SCAP组和NSCAP组中的分布均无统计学差异(P>0.05)。对3个位点进行单体型构建,发现GTT单体型与CAP风险增加相关(OR=1.626,P<0.05)。结论:IRGM基因rs4958843位点的T等位基因和GTT单体型可能与CAP易感性相关,且携带rs4958843位点T等位基因的患者炎症水平相对较高。

中国汉族人群NOD2、IRGM、ATG16L1和STAT4基因多态性与克罗恩病的相关性研究

背景:克罗恩病(CD)的病因和发病机制尚未完全阐明,近年国外研究发现NOD2、IRGM、ATG16L1、STAT4基因突变与CD相关。目的:分析NOD2、IRGM、ATG16L1、STAT4基因多态性与中国汉族人群CD发病的相关性。方法:连续纳入2007年1月～2010年1月苏州市立医院中国汉族CD患者66例,66名健康体检者作为正常对照,以PCR联合基因测序检测4种基因相应单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型,分析各基因型和等位基因频率。结果:CD组和正常对照组NOD2基因rs2066842位点、IRGM基因rs13361189位点、ATG16L1基因rs2241880位点和STAT4基因rs7574865位点基因型和等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,两组间4种基因相应SNP位点的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义。结论:NOD2、IRGM、ATG16L1和STAT4基因多态性与中国汉族人群CD发病不相关。

IRGM和ATG16L1基因多态性与中国汉族人群克罗恩病的相关性

目的分析IRGM和ATG16L1基因多态性与中国汉族人群克罗恩病(crohn’s disease,CD)发病的相关性。方法选取中国汉族CD患者和健康对照者各318例纳入研究,采用聚合酶链式反应和直接测序方法检测其IRGM和ATG16L1基因的基因型,比较两组间基因型和等位基因频率。结果 CD组和正常对照组IRGM基因rs13361189位点、ATG16L1基因rs2241880位点基因型和基因频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,两组间2种基因相应的SNP位点的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论虽然IRGM和ATG16L1基因的遗传变异与西方白种人CD的易感性相关,但是IRGM和ATG16L1基因多态性却与中国汉族人CD无明显相关性。

炎症性肠病患者自噬相关IRGM基因的表达变化及临床意义

目的探讨炎症性肠病患者自噬相关IRGM基因的表达变化及临床意义。方法收集2009年1月-2011年12月我院诊治的炎症性肠病患者共166例,其中溃疡性结肠炎患者98例,克隆恩病患者68例。收集患者的临床资料及其外周血5 ml,提取单个核细胞,采用RT-PCR法检测IRGM基因的表达变化,分析其表达变化的临床意义。50例健康人群作为对照组。结果对照组外周血IRGM仅少量表达(0.204±0.095),溃疡性结肠炎患者IRGM表达较对照组明显增高,且随着病情的加重IRGM表达量进行性增高(轻、中、重型分别为0.408±0.102、0.582±0.184和0.826±0.218),差异有统计学意义(P<0.05)。克隆恩病患者IRGM表达较对照组明显增高,且随着病情的加重IRGM表达量进行性增高(轻、中、重型分别为0.462±0.126、0.628±0.202和0.902±0.308),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IRGM基因可能参与炎症性肠病的起病,并与病情的严重程度相关。

Irgm1基因敲除对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠CD4^+ T细胞亚群的影响

目的:探讨免疫相关GTP酶1(Irgm1)基因敲除对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠CD4+T细胞的影响。方法:C57BL/6纯系小鼠与Irgm1基因敲除杂合小鼠(Irgm1+/-)回交十代繁殖C57BL/6背景下Irgm1+/-小鼠,用C57BL/6 Irgm1+/-小鼠杂交获取Irgm1-/-、Irgm1+/-、Irgm1+/+三种基因型小鼠,PCR扩增DNA检测基因型。用髓鞘少突胶质糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG33-55)多肽与弗氏完全佐剂等量混合制成乳剂,免疫C57BL/6野生型(Wt.)和Irgm1基因敲除(Irgm1-/-)小鼠,建立EAE模型,并进行临床评分。MTT法测定MOG33-55免疫后7 d的EAE小鼠淋巴结细胞中MOG33-55特异性T细胞增殖分化水平。取MOG33-55免疫后14 d EAE小鼠脊髓切片,HE染色检测炎细胞浸润情况。取MOG33-55免疫后16 d的EAE-小鼠淋巴结、脊髓和脑组织,提取单个核细胞,用MOG33-55(20μg/ml)体外刺激培养7 d,收集细胞,用流式细胞仪分析EAE小鼠淋巴结、中枢神经系统浸润细胞中Th1、Th17的改变。结果:成功诱导了EAE小鼠模型;HE染色结果显示Wt.小鼠脊髓周围出现明显炎细胞浸润,而Irgm1-/-小鼠则无明显变化;MTT实验表明Irgm1-/-小鼠与Wt.小鼠相比,淋巴结中T细胞对MOG33-55特异性增殖能力降低;流式细胞分析表明相对于Wt.小鼠,Irgm1-/-小鼠EAE模型在淋巴结及中枢神经系统浸润细胞中Th1细胞亚群比例明显增高而Th17细胞亚群比例下降。结论:Irgm1基因敲除可部分保护EAE小鼠的脊髓功能及临床症状。在EAE发病早期,Irgm1可能起到了关键性的作用,因此Irgm1有可能成为EAE治疗的重要分子靶点。

Irgm1在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脑脊髓中的表达

目的探讨IFN-γ诱导性免疫相关GTP酶Irgml在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病中的免疫调节作用。方法 1建立EAE动物模型:a.经典EAE小鼠模型;b.基因敲除小鼠(Irgm1-/-)EAE模型。2 EAE模型症状学评价。3在基因和蛋白水平检测Irgm1在经典型EAE小鼠脑和脊髓中的表达。结果 1成功诱导了小鼠EAE模型。2基因和蛋白水平检测经典型EAE小鼠Irgml的表达与对照组小鼠比较有统计学意义(P<0.05)。3经典型EAE小鼠Irgm1的表达在免疫后不同时间呈现先上升后下降的变化趋势。结论 1 EAE模型建立方法稳定、可靠。2 Irgm1在EAE发生、发展和恢复中起着复杂的免疫调节作用,可能是EAE发病的致病因素之一。

Irgm 1参与动脉粥样硬化斑块的形成

目的:探讨免疫相关GTP酶1(Irgm 1)对小鼠血管动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响。方法:高脂饲料喂养野生型(WT)、ApoE-/-Irgm 1+/+和ApoE-/-Irgm1+/-小鼠3个月,建立AS模型;取小鼠主动脉弓,免疫荧光染色方法观察WT和ApoE-/-Irgm 1+/+小鼠血管AS斑块中Irgm 1的表达情况及部位;Western blot方法检测WT和ApoE-/-Irgm 1+/+小鼠血管AS斑块中Irgm 1蛋白表达情况;Q-PCR方法检测WT和ApoE-/-Irgm 1+/+小鼠血管AS斑块中Irgm 1 m RNA表达情况;油红O染色观察ApoE-/-Irgm1+/+和ApoE-/-Irgm1+/-小鼠血管AS斑块形成情况;结果:与WT组相比,ApoE-/-Irgm 1+/+组小鼠主动脉弓AS斑块中Irgm 1+细胞明显增多,Irgm 1+细胞主要位于血管AS斑块的表面;与WT组相比,ApoE-/-Irgm 1+/+组小鼠血管AS斑块中Irgm 1蛋白表达显著增多(P<0.001),Irgm 1 m RNA表达显著增多(P<0.01);与ApoE-/-Irgm1+/-组相比,ApoE-/-Irgm1+/+组小鼠主动脉弓AS斑块面积显著增大(P<0.01);结论:Irgm 1能够促进血管AS斑块的形成。

小鼠免疫相关GTP酶Irgm基因家族的研究进展

免疫相关GTP酶（IRG）基因家族与抗感染和炎症免疫过程有关.小鼠Irgm1、Irgm2与Ir-gm3基因编码的蛋白参与细胞自噬、Colon氏病等发生发展,并在固有免疫应答中发挥重要作用.了解Irgm1、Irgm2与Irgm3基因的表达、功能等情况以及Irgm1、Irgm2与Irgm3基因编码的蛋白参与免疫过程的机制,有利于免疫系统疾病的治疗.

GTP酶-Irgm1对巨噬细胞亚型M1的影响

目的 就GTP酶-Irgm1对巨噬细胞亚型M1分化的影响及可能的机制进行探讨.方法 分别对小鼠腹腔原代巨噬细胞和小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞进行培养,通过流式细胞术并以CD11b及F4/80标记巨噬细胞.每种细胞分成siRNA干扰组与对照组,然后待细胞贴壁后24 h加入干扰素（IFN）-γ和脂多糖（LPS）体外诱导巨噬细胞向M1转化,再进行流式细胞术iNOS染色鉴定M1的百分比.最后利用Western blot和RT-PCR检测体外诱导M1细胞过程时IRF5、IRF8及iNOS的表达情况.结果 ①加入Irgm1 siRNA干扰组的M1百分比（3.4％）明显低于对照组（35.8％）,差异有统计学意义（P＜0.05）;②QPCR检测结果显示：加入Irgm1 siRNA的干扰组与对照组相比,IRF5和IRF8 mRNA表达明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blotting检测结果显示：加入Irgm1 siRNA干扰组与对照组相比,IRF5和IRF8蛋白表达明显减少,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 巨噬细胞内Irgrn1能够通过影响IFR5和IRF8的表达影响巨噬细胞型别的改变.

免疫相关GTP酶Irgm1对小鼠暂时性大脑中动脉缺血再灌注模型脑神经元自噬发生的影响

目的探讨免疫相关GTP酶1（Irgml）在小鼠暂时性大脑中动脉缺血再灌注模型（tMCAO）中的表达及其对tMCAO小鼠大脑神经元内自噬发生的影响。方法采用westernblotting和免疫荧光染色，检测Irgml和自噬相关基因LC3I／II及P62在Irgml^＋/＋小鼠tMCAO脑组织内的表达水平及细胞定位；进一步比较Irgml^＋/＋及Irgml。小鼠tMCAO大脑神经元内自噬发生的差异。结果相比于假手术（sham）组，Irgml在Irgml^＋/＋小鼠tMCAO脑组织中表达明显增高，且主要分布于损伤侧皮层神经元内；同时我们也证实在小鼠tMCAO脑组织中LC3-II表达增加（t=-16．448，P〈0．01），而P62表达明显减低（t=3．975，P〈0．05）。我们进一步实验发现Irgml。小鼠tMCAO脑组织内LC3-II表达量低于Irgml^＋/＋小鼠tMCAO（t=4．073，P〈0．05），而P62表达量高于Irgml^＋/＋小鼠tMCAO（t=-3．383，P〈0．05）。结论在小鼠tMCAO模型中，Irgml参与调节大脑神经元的自噬活动。

免疫相关GTP酶1通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬

目的探讨免疫相关GTP酶1(IRGM1)调控PI3K/AKT/mTOR通路对巨噬细胞自噬活动的影响。方法小鼠RAW264.7细胞常规传代培养,siRNA-IRGM1序列通过Lipofectamine 2000转染RAW264.7细胞制备siRNA-RAW246.7细胞;利用脂多糖(LPS,20 ug/mL)诱导RAW246.7构建细胞自噬模型,分为四组:RAW246.7组,siRNA-RAW246.7组,RAW246.7+LPS组,siRNA-RAW246.7+LPS组;Western blot检测各组IRGM1及自噬相关分析分子(LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62)、AKT及mTOR磷酸化水平;qRT-PCR检测各组IRGM1及P62表达水平;利用流式细胞学比较各组细胞凋亡率和ELISA检测各组IL-6炎症因子表达情况。结果Western blot结果显示:与RAW246.7组、siRNA-RAW246.7组比较,LPS诱导巨噬细胞(RAW246.7+LPS组、siRNA-RAW246.7+LPS组)自噬相关基因LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例蛋白表达升高(P<0.05),P62表达明显下降(P<0.05)。其中与RAW246.7+LPS组比较,siRNA-RAW246.7+LPS组自噬活动显著降低(P<0.05),同时流式细胞检测提示siRNA-RAW246.7+LPS组细胞凋亡率显著低下(P<0.05);说明沉默IRGM1抑制了巨噬细胞自噬活动。与RAW246.7+LPS组比较,siRNA-RAW246.7+LPS组的P-AKT及P-mTOR磷酸化水平低(P<0.05)。ELISA检测结果提示:与RAW246.7+LPS组比较,siRNA-RAW246.7+LPS组的IL-6表达水平低(P<0.05)。结论IRGM1与细胞自噬活动有关,并且可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬。

克罗恩病相关基因的研究进展

克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种由多个基因共同参与的胃肠道慢性炎性肉芽肿性疾病。本文对近年来CD的相关基因NOD2/CARD15、ATG16L1、IRGM、IL-23/TH17信号通路、PTGER4、IBD5基因位点、PTPN2的研究进展进行总结。通过检索PUBMED及CNKI数据库,以"克罗恩病、相关的基因、发病机制"为关键词,以CD的相关的基因和其致病机制、相关基因在CD中的作用及临床意义、CD相关基因位点临床治疗效果为纳入标准,检索了2000年1月至2017年8月的相关文献。发现NOD2/CARD15、ATG16L1、IRGM、IL-23/TH17信号通路、PTGER4、IBD5基因位点、PTPN2等基因与CD的遗传易感性密切相关。这些基因与CD的临床表现、治疗效果和患者生存率等相关,为CD今后发病机制的研究,及相关基因靶向的治疗奠定了理论基础。

免疫相关GTP酶基因多态性与克罗恩病遗传易感性关联的Meta分析

目的旨在采用Meta分析评价免疫相关GTP酶（immunity-related GTPase M,IRGM）基因常见位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）与克罗恩病（crohn＇s disease,CD）遗传易感性的具体关联。方法全面检索中英文电子数据库,检索年限从建库至2013年10月。Meta分析采用STATA 12.0软件,通过计算优势比（odds ratio,OR）及其95%可信区间（95%confidence intervals,95%CI）评价关联性。结果 11项病例对照研究符合纳入标准,包括5 183例CD患者和5 571例健康对照人群。Meta分析结果表明,IRGM基因rs13361189多态性与CD遗传易感性增加有关（C比T：OR=1.30,95%CI：1.05-1.61）,但rs10065172和rs4958847多态性与CD遗传易感性之间无明确统计学关联（均P〉0.05）。种族亚组分析表明,IRGM基因多态性与欧美人群CD发生风险增加有关（C比T：OR=1.22,95%CI：1.07-1.40,P=0.004）,但与亚洲人群无显著统计学关联（均P〉0.05）。结论 IRGM基因rs13361189多态性可能与CD遗传易感性增加有关,它可以作为早期诊断CD的重要分子标志物。

自噬相关基因多态性与克罗恩病

自噬是细胞降解自身长寿命蛋白、受损细胞器或入侵病原体,以维持自身稳态的现象。最近,利用全基因组关联扫描技术发现,ATG16L1、IRGM等自噬相关基因的单核苷酸多态性与克罗恩病的发生有关。该文综述了这些自噬相关基因多态性以及细胞自噬缺陷与克罗恩病发生发展过程的关系。