基于重测序鉴定GbTMEM214基因在陆地棉基因组的插入位点

【目的】利用农杆菌介导法获得了转GbTMEM214基因陆地棉品系,旨在明确转基因棉花株系中T-DNA插入位点的序列特征及检测方法,为其生物安全评价提供依据。【方法】基于基因组重测序技术,利用BLASTn将测序数据与陆地棉TM-1基因组序列进行比对分析,设计特异性引物通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证插入位点。【结果】携带目标基因GbTMEM214的T-DNA整合在陆地棉基因组D13号染色体57019068~57019106 bp,T-DNA插入导致受体基因组37 bp的片段缺失;通过PCR扩增获得携带GbTMEM214基因的T-DNA插入位点的侧翼序列,由此建立了转GbTMEM214基因棉花的特异性检测方法。【结论】基于基因组重测序技术获得了转GbTMEM214基因棉花的T-DNA插入位点及侧翼序列信息,可为转基因棉花的生物安全评价提供技术参考。

水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌致病力降低T-DNA突变体的筛选与插入位点鉴定

为深入研究水稻立枯病原菌尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum Schelcht)致病分子机理,利用根癌农杆菌介导遗传转化技术构建尖孢镰孢菌突变体库,筛选致病力降低突变体,检测其T-DNA插入数量和位点。结果表明,691个突变体库构建成功,且突变体可稳定遗传后代。选取34个不同菌落形态变化突变体测定其致病力,筛选到6个致病力降低最严重突变体,分析其菌落形态、菌落生长速率和产孢量。与野生型相比,菌落形态存在差异,其中4个突变体B9、C36、D65、E17生长速率降低,6个突变体产孢数量均降低。通过Southern blot分析发现突变体B92有两个T-DNA插入,其余5个突变体为单个T-DNA插入,利用Hi TAIL-PCR确定6个突变体T-DNA插入位点。结果有助于更好理解尖孢镰孢菌与水稻之间分子相互作用,为进一步确定尖孢镰孢菌致病基因及其功能提供参考。

转基因小麦外源基因插入位点初步分析及检测方法的建立

利用染色体步移（genome—walking）原理和巢式PCR方法，对转基因小麦外源基因sGNA插入位点的序列特征进行了分析，并以此建立了sGNA基因转化事件特异性检测的方法。根据sGNA基因的核苷酸序列设计特异引物，利用Takara公司提供的简并随机引物，通过染色体步移法扩增到了转sGNA基因株系zy2—18的插入位点的边界序列，分析得到的边界序列可知，外源基因片段是通过部分同源重组的方式与小麦基因组进行整合的，整合位点位于A染色体组。检测结果显示携带外源基因sGNA的质粒在与小麦基因组整合的过程中发生了剪切，且Ubi启动子与bar基因被切除，保留了两个串联的NOS基因，且在4500～4520bp区间发生了重组后的缺失，而在4786—4810bp区间有一段碱基序列插入，导致插入区段的小麦基因组序列发生重排，初步分析外源基因是通过同源重组的方式进行整合的。通过验证，证明了插入位点信息的准确性，并初步判断插入位点位于小麦A染色体组。因此，随机引物法genome—walking可以作为转基因小麦安全检测及身份识别的有效方法。

基于重测序鉴定SbHKT基因在陆地棉基因组中的插入位点

【目的】明确SbHKT基因棉花HKT-1株系的插入位点序列特征。【方法】对HKT-1株系重测序,本地BlastN比对获得插入位点处的侧翼序列,设计聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)特异引物验证插入位点的准确性。【结果】获得SbHKT基因插入位点处107 bp的左边界(Left border,LB)端侧翼序列HKT1_LSEQ,122 bp的右边界(Right border,RB)端侧翼序列HKT1_RSEQ;锚定基因组后显示SbHKT基因的插入引发了陆地棉染色体结构变异。分别根据LB和RB端侧翼序列设计PCR特异引物扩增HKT-1株系T-DNA全长,目的条带含有完整的T-DNA骨架序列以及SbHKT基因序列,证实HKT1_LSEQ和HKT1_RSEQ是同一个插入位点的左右侧翼序列。【结论】基于重测序技术获得了SbHKT基因在陆地棉基因组中的侧翼序列,建立了SbHKT基因转化体特异性检测方法。

转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析

为寻找谷氨酸棒杆菌转座子插入突变菌株中的转座子插入位点 ,采用了转座子挽救法对转座子及其插入位点附近的序列进行分离 ,并测定插入位点相邻DNA序列 ,获得了三个转座子插入位点DNA序列 ,其中一个是柠檬酸合成酶基因 ,另两个为目前未知基因 ,暂命名为orfA和orfB。该方法简便易行 。

转座子插入位点的鉴定方法

转座子是基因组中的可移动成分,已经成为分子生物学研究中的一种有用的研究工具。转座子插入位点识别的难易决定着转座子应用的潜能。本文介绍曾应用过的几种转座子插入位点周围染色体序列的克隆测序方法及其优缺点。

转座因子IS10一个新的插入靶位点的序列分析(英文)

转座因子在生物体内广泛存在,它在研究基因的重组机理以及生物染色体的进化方面有着重要意义。IS10是细菌中的一种转座因子,它既能单独作为插入序列,也能作为Tn10的一部分进行转座。利用含sacB基因的质粒pXT3sacB,获得了由转座因子IS10插入而导致sacB基因失活的突变体。通过对插入突变体质粒DNA的序列测定(GenBank登记号为AY580883.1),结果表明IS10两端分别包括22bp倒置重复区CTGAGAGATCCCCTCATAATTT和AAATCATT-AGGGGATTCATCAG,这与前人的报道一致;而IS10两端的插入靶位点序列为TGCTTGGTT,该9bp靶位点序列与前人报道的序列NGCTNAGCN不同。根据文献资料,本研究中的靶位点序列是首次报道。此外,通过Southernblot杂交分析,插入sacB基因中的IS10来源于宿主大肠杆菌DH5α染色体DNA,并且IS10在DH5α染色体中为两个拷贝。此外,本研究利用sacB基因捕获到转座因子IS10,该方法为研究其他插入序列提供了一个有益的体系。

急性髓系白血病患者细胞淋巴瘤滤过性病毒插入位点1的表达水平与凋亡的关系

目的 分析急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者外周血B细胞淋巴瘤滤过性病毒插入位点1(B cellspecific moloney leukemia virus insert site-1,BMI-1)的表达水平及其与血清B细胞淋巴瘤基因-2家族(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、原癌基因(proto-oncogene,c-myc)的关系。方法 选取2016年2月至2021年2月于安徽医科大学第一附属医院东区就诊的80例AML患者作为观察组,选取同期80例健康体检的志愿者作为对照组。定量反转录PCR检测受试者外周血BMI-1 mRNA表达水平。酶联免疫吸附试验检测两组血清Bcl-2、c-Myc、白细胞介素6、白细胞介素10、转化生长因子-β水平。入组后记录两组受试者白细胞计数、红细胞计数、血小板计数及血红蛋白水平。Pearson分析外周血BMI与血清Bcl、c-Myc水平相关性。结果 观察组患者白细胞计数、红细胞计数、血小板计数和血红蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)。观察组患者白细胞介素6、白细胞介素10水平高于对照组,转化生长因子-β水平低于对照组(P<0.05)。观察组患者外周血BMI mRNA表达水平、血清Bcl、c-myc明显高于对照组(P<0.05)。外周血BMI mRNA水平与血清Bcl-2与、c-Myc之间均呈正相关(r=0.624,P=0.023;r=0.454,P=0.035)。结论 BMI mRNA、Bcl、c-myc在AML中表达较高,参与AML的发生发展过程,可为临床诊断和治疗AML提供一定的理论依据。

插入缺失位点和miniSTR在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用检测

目的:研究插入缺失位点InDel与mini短串联重复序列(STR)遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织应用的价值。方法:19份甲醛固定石蜡包埋组织作为疑难检材,应用3种常染色体遗传标记多重扩增系统,即InDel系统(Investigatior■DIPplex Kit)、miniSTR系统(华夏白金扩增试剂盒)和STR系统(Goldeneye®20A),对STR分型不完整或失败的检材,再分别用InDel和miniSTR系统进行DNA分型检测,比较两者的分型质量和检出率。结果:19份甲醛固定石蜡包埋组织经Goldeneye 20A试剂盒检测,均分型不完整。应用miniSTR系统检测显示,7份样本的检出率100%,其中,D19S433基因座的检出率为100%,D5S818、D13S817和D1S1656基因座的检出率最小,为36.84%。应用InDel系统检测发现,1份样本InDel位点电泳分型完整,所有样本的位点丢失率均小于50%,其中7份样本的位点丢失率低至10%以下。结论:应用遗传标记对甲醛固定石蜡包埋组织这类疑难降解检材进行检测,插入缺失多态性位点InDel与miniSTR可以作为联合检测标记。

肺腺癌组织中B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点基因1表达与患者临床指标及预后的相关性

目的检测肺腺癌组织中B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点1（Bmil）表达，并分析其与肺腺癌患者的转移、疗效及预后的相关性。方法免疫组织化学方法检测肺腺癌组织Bmil表达。r检验分析Broil表达与临床病理指标的关系，以Kaplan—Meier生存曲线计算生存率，采用Cox分析评估各指标与患者生存之间的关系。结果126例肺腺癌组织中，72例可观察到Bmil阳性细胞，阳性率为57．1％。Broil表达与肺腺癌患者转移及化疗疗效密切相关（P=0．000或P=0．021），且与患者无病生存期和生存期呈明显负相关。多因素分析结果显示，转移、Bmil表达以及转移后化疗疗效均是影响生存时间的独立因素[β值分别为-6．212、1．015、0．867，95％置信区间分别为0．000～0．019、1．727～4．405、1．680～3．372，均P=0．000]。结论Bmil表达与肺腺癌患者的转移及化疗耐药相关，提示预后不良。

产志贺样毒素的噬菌体φ297在大肠杆菌K514染色体上插入位点的定位研究

目的 鉴定噬菌体φ2 97在大肠杆菌K5 1 4染色体上的插入位点。方法 采用加接头PCR、分子克隆、亚克隆等分子生物学方法从与噬菌体933W的整合酶基因int同源的核苷酸序列开始向未知区域进行步移测序,寻找目的基因。将获得的DNA序列与核苷酸数据库进行比较。结果 确定了细菌性噬菌体φ2 97的attL、attR和中心序列位于大肠杆菌K5 1 4的yecE 基因内。结论 噬菌体φ2 97在宿主细胞E coliK5 1 4染色体上的整合位点是yecE基因。

植物外源基因拷贝数及插入位点的检测方法与技术

随着转基因技术的快速发展,转基因植物在世界范围内已经大量种植.近年来,转基因植物的安全性越来越受到公众关注.转基因植物安全性与有效性的关键因素是外源基因拷贝数与插入位点.本文综述了近年来植物外源基因拷贝数与插入位点的检测方法.

基于全基因组重测序技术鉴定转基因大豆插入位点的方法

明确的插入位点及其旁侧序列是转基因材料进入生物安全评价更高阶段的必要条件。传统的插入位点鉴定方法以基于已知外源序列的PCR扩增技术为基础,主要有TAIL-PCR和Genome walk ing等。大豆是一个古四倍体农作物,近75%的基因以多拷贝或复杂拷贝的形式存在,因此,传统的以PCR为基础的插入位点鉴定方法在转基因大豆中工作效率并不高。

烟草T-DNA插入位点侧翼序列扩增方法的筛选与优化

烟草T-DNA激活标签插入突变体库的创制过程中,需要进行大量的T-DNA插入位点的侧翼序列扩增,因此选择一种适用于烟草T-DNA侧翼序列扩增的高效方法尤为必要。本研究比较了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三种方法对T-DNA插入位点侧翼序列的扩增效率、插入位点确定的比例和同源蛋白比对结果,并对3种方法的PCR程序、体系和引物设计等方面进行了优化,确定TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增,通过产率、条带长度、插入位点和同源蛋白比对结果的比较,得出TAIL-PCR更适合烟草的侧翼序列扩增。这一结果为应用烟草突变体开展烟草基因功能的研究奠定了基础。

利用重测序技术获取转基因植物T-DNA插入位点

T-DNA插入位点的获得对于植物功能基因组学研究及转基因植物的筛选鉴定非常重要,但是目前常用的方法如反向PCR、半随机引物PCR等,除了操作复杂、消耗时间长外,特异性较差,效率也很低。本研究利用全基因组重测序技术,将3份转基因材料基因组DNA打包后进行重测序,利用转基因载体序列作为参考序列进行比对分析,得到4个T-DNA插入位点。对3份转基因材料进行PCR和Southern blot验证分析,成功获得了3份转基因材料全部T-DNA插入位点,其中1份材料为2拷贝插入。本文利用重测序技术建立了一种简单、可靠、高效的获取转基因植物T-DNA插入位点的方法,以期为植物功能基因组学及转基因研究奠定基础。

红色荧光蛋白mCherry中插入外源短肽位点的研究

荧光蛋白及其突变体广泛应用于细胞生物学、分子生物学及医学等领域,而围绕荧光蛋白建立的各种新技术,如BiFC(双分子荧光互补技术)、FRET(荧光能量共振转移技术)、Optical highlighter(荧光笔探针)等,则极大地促进了多个生物相关学科的发展。采用转座子突变技术,在红色荧光蛋白mCherry中随机插入5个氨基酸残基。经流式细胞仪检测和分选,成功获得13个插入外源氨基酸短肽后,仍具有荧光活性的mCherry荧光蛋白突变体,为BiFC以及构建新型生物感受器提供了更多可插入外源DNA的合适位点。

人工构建含丙型肝炎病毒核糖体插入位点的双顺反子表达载体

目的:研究丙型肝炎病毒核糖体插入位点启动翻译蛋白质功能,构建双顺反子真核表达载体.方法:逆转录PCR(RT-PCR)扩增丙型肝炎基因组中核糖体插入位点序列(IRES),定向克隆到pcDNA3-S质粒多克隆酶切位点中。在IRES下游克隆乙型肝炎病毒核心基因,测序鉴定后获得的质粒经脂质体转染hepG2细胞,间接免疫荧光染色和Western-blot检测.结果:在间接免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见已型肝炎病毒S基因和核心基因表达。转染细胞破碎后免疫沉淀检测和图像分析表明,两种基因有相似的表达量。结论:人为截断HCV 5’NTR区17个碱基,并不影响IRES对下游基因蛋白质翻译,为成功构建了含丙型肝炎病毒IRES的双顺反子表达载体打下基础。

贵州仡佬族和苗族人群30个插入/缺失位点遗传多态性分析

目的调查贵州仡佬族和苗族人群30个插入/缺失(InDel)位点的遗传多态性,并评估其在法医学中的应用价值。方法用Investigator~? DIPplex试剂盒分别对贵州220例仡佬族和207例苗族无关个体外周血样进行30个InDel分型检测,统计分析各位点的频率数据、群体遗传学参数,并与其他地区人群已有数据进行比较。结果 30个InDel位点经Bonferroni校正,其基因型分布在贵州仡佬族和苗族群体均符合Hardy-Weinberg平衡,且不存在连锁不平衡现象;各位点在贵州仡佬族和苗族人群中的累积个体识别率分别为0.999 999 999 34和0.999 999 996 86,三联体累积非父排除率均≥0.995 6;30个InDel位点在贵州仡佬族和苗族中均有4个位点的期望杂合度<0.3。通过Genepop 4.2软件计算F_(st)值,除D111(0.137 5)和D118(0.091 1)外,其余位点均小于0.06。从Nei′s DA遗传距离矩阵分析发现,贵州仡佬族与成都汉族的遗传距离最小(0.001 0),贵州苗族与新疆哈萨克族的遗传距离最大(0.026 4)。结论 Investigator■ DIPplex试剂盒中包含的30个InDel位点在贵州仡佬族和苗族人群中具有较好的遗传多态性,可作为个体识别等特殊检案有效的补充体系。

PSORA:一种基于高通量测序的T-DNA插入位点分析方法

【目的】建立一种批量分析T-DNA插入位点的简单、有效的方法。【方法】提供一种基于高通量测序技术的T-DNA插入位点的分析方法,将其命名为PSORA:Parallel sequencing of one round amplicons。首先对一轮交错式热不对称PCR(TAIL-PCR)的扩增产物进行高通量测序,随后通过生物信息学分析T-DNA插入位点,该方法降低了TAIL-PCR过程中对特异性扩增的要求。PSORA中使用的引物一侧为简并引物,另一侧为T-DNA特异性引物。在特异性引物的5’端设计6 nt的样品标签(Barcode),用于标记不同的转化事件。所使用的5个转基因烟草株系(L1、L6、L9、L15和L19)由农杆菌介导质粒pBI121转化获得。此外,通过标准PCR对PSORA的结果进行验证。【结果】利用PSORA对5个转基因株系的T-DNA插入位点进行分析,结果显示,L6含2个插入位点(NW_015801367的36316 bp处和NW_015950898的42202 bp处),L9、L15和L19各含1个插入位点(L9的插入位点为NW_015943682的235969 bp处;L15的插入位点为NW_015802951的60529 bp处;L19的插入位点为NW_015863435的12188 bp处),L1的插入位点未能成功获取。对生物信息学分析结果进行PCR验证,含不同插入位点的转基因株系之间可互为阴性对照,野生型(WT)作为空白对照,结果表明,在各转基因株系中均得到与预期一致的特异性扩增,该结果验证了PSORA的有效性。【结论】PSORA是一种分析T-DNA插入位点的有效方法,可以同时分析多个插入事件,相对于传统的染色体步移方法更简便、快速。