泛素样蛋白ISG15抗冠状病毒感染作用的研究进展

干扰素刺激基因15(ISG15,interferon-stimulated gene 15)是一种泛素样蛋白,在调节机体天然免疫和抗病毒感染过程中发挥重要作用。ISG15在针对流感病毒、乙型肝炎病毒、HIV病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、巨细胞病毒等病毒的抗病毒研究已有文献报道。除此以外,最新的研究表明ISG15分子会在新型冠状病毒的木瓜蛋白酶样蛋白酶的作用下失活,从而抑制其抗病毒功能。因此抑制新型冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶,除能直接阻断病毒的生命周期、抑制病毒在体内的复制以外,同时也会提升ISG15分子水平,继而间接提升机体免疫能力,降低感染风险。该文介绍ISG15抗新冠病毒的过程,重点介绍ISG15抗冠状病毒作用的特异性,此外,总结新冠病毒通过木瓜蛋白酶样蛋白酶阻断ISG15介导的天然免疫实现免疫逃避的机制,并罗列了潜在的木瓜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。本文从ISG15抗病毒天然免疫的分子机制角度,总结抗SARS-CoV-2药物的最新进展,并对相关药物的研发前景进行展望。

ISG15在恶性肿瘤中的作用及机制研究进展

干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene15,ISG15)是最早发现的泛素样蛋白,在恶性肿瘤中显示出复杂的致癌或抗癌双重活性,然而其具体调控机制仍未阐明。近年来研究发现ISG15通过调控DNA复制分叉进程、自噬及线粒体功能、免疫微环境及靶蛋白的翻译后修饰等参与恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭转移、干细胞干性及耐药等,是潜在的诊断、预后标志物及治疗靶点。该文就ISG15调控恶性肿瘤发生发展作用机制的最新发现进行综述。

大黄鱼(Larimichthys crocea)ISG15基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性研究

由哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)等细菌感染引起的弧菌病对我国大黄鱼(Larimichthyscrocea)的养殖造成了严重危害。通过哈维氏弧菌人工感染大黄鱼建立易感组和抗病组,采用PCR扩增和直接测序法对大黄鱼干扰素刺激基因ISG15双拷贝(ISG15-1和ISG15-2)进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和分型,并与其哈维氏弧菌抗性进行关联分析。结果表明,从大黄鱼ISG15-1和ISG15-2基因中分别筛选到10个和4个SNP位点并进行了成功分型。经统计分析, ISG15-1基因的186 G/C和318 C/T位点以及ISG15-2基因的297G/T位点的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中均存在极显著差异,表明这3个SNP位点与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关。连锁不平衡分析结果显示,ISG15-1的SNPs可形成1个单倍块和11种单倍型,而ISG15-2的SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型。其中, ISG15-1基因的单倍型H2(CCCCGGTACC)、H6(TCCCACTGTC)和H9(TCCCAGTGCC)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关;ISG15-2基因的单倍型H1(CCCG)和H4(TCCG)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性极显著相关。这些ISG15-1和ISG15-2基因的SNP位点以及单倍型可以作为抗哈维氏弧菌病大黄鱼选育的候选分子标记。

ISG15蛋白对感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊的免疫调节作用

为研究重组绵羊ISG15蛋白(rISG15)对感染绵羊肺炎支原体后的盘羊杂交羊的免疫调节效果,本研究将18只盘羊杂交羊随机分为A、B、C 3个组,6只巴什拜羊为D组,全部人工感染绵羊肺炎支原体(CCU=106),感染5 d后A和D组肌肉每天注射生理盐水作为对照组;B和C组每天分别肌肉注射盘羊杂交羊和巴什拜羊的rISG15 200μg/只,并采用荧光定量PCR方法检测试验羊不同时间血液中ISG15、IL-12、IFN-γ的表达水平。结果显示,IFN-γ表达水平在感染第14 d,B组显著高于A、D组(p<0.05),第21 d,B、C组显著高于A、D组(p<0.05);ISG15的表达量在第14 d与21 d,B、C、D组的表达水平显著高于A组(p<0.05);而在此期间,A组的IL-12表达水平显著高于其它各组(p<0.05),但仅A组出现50%的死亡率。实验数据表明rISG15对易感的盘羊杂交羊具有一定的免疫调节效果,为绵羊支原体肺炎防治提供了实验依据。

猪ISG15基因表达、多态性及其与繁殖性状的关联分析

【目的】明确干扰素刺激基因15(ISG15)在猪不同妊娠时期母胎界面中的表达规律,分析ISG15基因多态位点在中外猪种中的遗传多样性及与繁殖性状的关联性,拟为揭示ISG15基因在猪繁殖功能中发挥的作用提供重要数据。【方法】利用实时荧光定量PCR方法检测ISG15基因在大白猪妊娠15,26,50 d子宫内膜和绒毛膜中的表达水平变化,通过测序比对筛选ISG15基因多态位点,采用PCR-RFLP方法检测多态位点在大白、梅山猪、清平猪、通城猪、大花白猪中的遗传多样性,并利用SPSS19.0分析ISG15基因多态位点与繁殖性状的关联性。【结果】ISG15基因在妊娠26 d子宫内膜和绒毛膜组织中表达水平均显著高于妊娠50 d(P<0.01),并于第二外显子中存在一个NM_001128469.3:c.301A>G同义突变位点。该位点在5个猪品种群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态,但在地方猪种中,c.301A>G位点处于低度多态,以AA基因型为主,而在大白群体中,c.301A>G位点则处于中度多态,以AG基因型为主。进一步进行繁殖性状关联分析,结果显示,在大白经产母猪群体中,AA基因型母猪在总产仔数和产活仔数方面均显著高于AG基因型和GG基因型母猪(P<0.05)。【结论】ISG15基因在妊娠早期母胎界面中表达,其c.301A>G位点基因型在中外猪种中呈差异分布,且与产仔数性状显著性相关,暗示ISG15基因可能参与猪产仔数性状的调控。

ISG15蛋白促进猪源牛病毒性腹泻病毒2型对Ⅰ型IFN表达抑制的研究

为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。

绵羊ISG15基因的克隆表达与纯化

为了克隆并表达绵羊ISG15,且对其表达产物进行纯化,首先从绵羊外周血单核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ISG15的基因;再通过基因克隆技术,构建ISG15在pET28a中的重组表达质粒pET28a-ISG15,在大肠杆菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达,得到ISG15的原核表达蛋白;最后采用Ni 2+-NTA亲和层析方法纯化目的蛋白。结果显示:克隆的绵羊ISG15基因序列长度为541bp,编码157个氨基酸。重组表达产物通过SDS-PAGE可检测到相对分子质量为25ku的重组蛋白,且表达的目的蛋白能被Ni 2+-NTA亲和层析方法所纯化。该研究为后续深入研究绵羊ISG15奠定基础。

新疆野生盘羊ISG15基因的克隆表达

本研究旨在克隆表达新疆野生盘羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。首先,利用RT-PCR和RACE技术克隆盘羊ISG15基因的cDNA全长序列,再将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni 2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,最后通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的新疆野生盘羊ISG15基因cDNA全长为642bp,开放阅读框为474bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33ku,表达的蛋白可用Ni 2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。

乌鳢(Channa argus)干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子的克隆与特征分析

应用抑制差减杂交、末端快速扩增和基因步移技术,克隆并鉴定了乌鳢干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子序列.Viperin cDNA全长1474nt,包含1059nt的开放阅读框,编码352个氨基酸.除N末端70个氨基酸外,Viperin蛋白氨基酸序列在鱼类和哺乳类具有高度的保守性.ISG15 cDNA全长758nt,包含468nt的开放阅读框,编码155个氨基酸,含有两个泛素样(UBL)结构域,C末端具有保守的UB偶联结构(LRGG).Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件(ISRE)和γ-干扰素激活序列(GAS).ISRE是干扰素刺激基因启动子区的重要特征,并与干扰素调控因子(IRF)1和IRF2的识别序列(IRF-E)部分重复;GAS参与介导II型干扰素激活基因的诱导转录.Viperin启动子区还包含保守的NF-κB结合位点,这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式(GGGRNNYYCC)出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道.此外,Viperin和ISG15启动子尚存在TATA,CAAT,Sp1等转录因子结合位点.乌鳢ISG15基因5′非编码区含有单一的内含子,而Viperin基因5′非编码区未发现内含子.Viperin和ISG15mRNA主要表达在头肾、后肾、脾脏和鳃,肝脏中也有少量表达.体内干扰素诱导剂polyI:C刺激后,Viperin和ISG15基因在肝脏的表达水平明显增加.

巴什拜羊ISG15基因的克隆与序列分析

本研究旨在了解新疆巴氏拜羊类泛素蛋白ISG15基因的序列特征。采集巴什拜羊外周血液,从中分离得到淋巴细胞并提取RNA,设计特异性引物进行RT-PCR,克隆出巴什拜羊ISG15基因序列,回收PCR产物与pMD18-T载体连接后转化DH5α,检测阳性克隆、测序并进行序列分析。结果表明,克隆的巴什拜羊ISG15基因编码区全长为522bp,编码172个氨基酸。BLAST结果表明,巴什拜羊ISG15基因与绵羊、山羊、小尾寒羊、水牛、牛和野猪的ISG15基因序列同源性分别为99%、98%、95%、94%、94%和82%。构建基因进化树分析结果显示,巴什拜羊与绵羊先聚为一类,再与小尾寒羊聚为一类,然后和牛聚为一类。该聚类结果与生物学上的分类一致。

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。

鞍带石斑鱼isg15基因cDNA克隆及其在虹彩病毒感染下的表达分析

本研究利用PCR和RACE技术首次获得了鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)干扰素刺激基因15(interferon stimulated gene 15,isg15)全长序列。isg15基因序列长为910 bp,包含一个468 bp的开放阅读框,可编码155个氨基酸,预测分子量为17.09 kDa,理论等电点为9.33。保守结构域分析显示,鞍带石斑鱼ISG15蛋白包含2个类似泛素结构域,且C末端具有高度保守的“Leu Arg Leu Arg Gly Gly(LRLRGG)”结构域。序列分析和系统发育分析显示,鞍带石斑鱼与斜带石斑鱼(E.coioides)isg15的相似性最高,为88.24%,与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)isg15的相似性分别为61.18%和60.59%。采用实时荧光定量PCR技术检测了鞍带石斑鱼健康组织中的isg15表达,以及虹彩病毒(iridovirus)感染后不同时间脾脏和肾脏中的isg15表达变化。结果显示,isg15在血液中的表达量最高,在肝脏、肾脏等组织中的表达量较高。经虹彩病毒感染后,isg15在脾脏和肾脏中的表达显著升高,在72 h到达最高水平,说明isg15在鞍带石斑鱼防御虹彩病毒的过程中发挥着重要作用。对鞍带石斑鱼isg15基因的分析和表达模式的研究,有助于进一步了解isg15基因在硬骨鱼体内的抗病毒调控机制,为鞍带石斑鱼抗病分子育种提供基础数据。

ISG15蛋白在乳腺癌中的表达及临床意义

目的研究ISG15蛋白在乳腺癌中的表达及其与临床病理参数的相关性和临床意义。方法收集105例手术切除的乳腺癌组织标本,采用Envision免疫组化法检测ISG15蛋白的表达,并进行组织评分,统计分析ISG15表达水平与患者临床病理参数的相关性。结果 ISG15蛋白在乳腺癌组织中呈高表达,免疫组化评分为5.17±1.07;其中Basal-like型"三阴性"乳腺癌在4种分子病理分型乳腺癌中评分最高6.20±1.13(P<0.05);ISG15的表达与TNM肿瘤分期呈正相关,与抑癌基因HER-2的表达水平呈负相关(P<0.05),而与患者年龄、是否绝经、淋巴结转移、肿瘤大小、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达均无明显相关(P>0.05)。结论 ISG15蛋白表达与乳腺癌组织TNM分期及抑癌基因HER-2表达水平相关,ISG15蛋白水平对患者乳腺癌的病情评估和预后有一定的临床价值。

干扰素刺激基因ISG15、OAS1和RSAD2在奶牛早期妊娠诊断中的应用

研究旨在探讨干扰素刺激基因15(Interferon stimulated gene 15,ISG15)、2′-5′寡腺苷酸合成酶1(2′-5′-oligoadenylate Synthetase 1,OAS1)和S-腺苷甲硫氨酸基区域蛋白2(Radical S-adenosyl methionine domain containing 2,RSAD2)对奶牛早期妊娠诊断的价值,为其在奶牛早期妊娠诊断中的应用提供理论依据。36头青年母牛分别于人工授精(artificial insemination,AI)后0d、18d、21d、28d采集外周血,利用荧光定量PCR技术对ISG15、OAS1和RSAD2在18d外周血总白细胞中的相对表达量(相对于0d)进行了分析;分别利用化学发光法和ELISA技术对血清孕酮(18d、21d)和牛妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoprotein,PAG),(28d)进行了检测。通过建立受试者工作特征曲线(ROC曲线)综合评估了三个候选生物标志物单独或联合检测在奶牛早期妊娠诊断中的统计学指标,并与孕酮检测和PAG检测的诊断效能进行了同步比较分析。对ISG15、OAS1和RSAD2三者的分析结果表明,ISG15与RSAD2联合检测的敏感性和特异性分别为94.7%和100%,具有最优的诊断价值;以血清中孕酮含量作为参考指标时,AI后21d妊娠诊断的敏感性和特异性与18d相比较优,分别为88.9%和94.1%,但诊断效能不及ISG15、RSAD2二者联用;PAG ELISA最早于AI后28d可做出诊断,且相对于ISG15-RSAD2联用其诊断的特异性较低,为94.12%。综上所述,利用ISG15和RSAD2基因不仅可望在AI后18d成功实现妊娠诊断而且具有最高的灵敏度和特异性,研究结果为下一步建立奶牛新型早期妊娠诊断技术奠定了基础。

牛源ISG15蛋白的原核表达及抗血清的制备

本研究利用人重组干扰素IFNα-2A刺激牛肾细胞(Mardin-Darby bovine kidney cells,MDBK),并提取细胞总RNA。RT-PCR扩增牛源干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG 15),将其克隆入p Cold-TF表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达后,获得约70 k Da可溶性ISG15重组蛋白。用试剂盒对重组蛋白ISG15进行纯化回收,经BCA法测定其蛋白浓度为1 mg/m L。用纯化的ISG15重组蛋白免疫ICR小鼠,制备多克隆抗体血清,用间接ELISA方法测定多抗血清效价为1:102 400。利用Western blot进一步鉴定ISG15多抗血清,结果发现其与纯化的ISG15重组蛋白能发生特异性反应,可用于后续研究。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ISG15 mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ISG15 mRNA表达及其与疾病活动性的关系。方法采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测89例SLE患者(活动期50例、缓解期39例)、结缔组织病(CTD)患者34例(疾病对照组)、健康体检者35名(健康对照组)外周血PBMCs中ISG15 mRNA的表达水平和含量。以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的变化。结果活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于缓解期SLE患者(ΔCt=5.48±1.72,t=11.572,P<0.01);活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于疾病对照组(ΔCt=5.90±1.72,t=12.69,P<0.01)和正常对照组(ΔCt=5.66±1.63,t=12.359,P<0.01);缓解期SLE患者ISG15 mRNA表达水平与正常人及疾病对照组的差异无显著性(P>0.05)。SLE患者PBMCs中ISG15 mRNA的表达水平与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)评分及抗双链DNA抗体呈显著正相关(均P<0.01),与补体C3、C4呈显著负相关(均P<0.01)。结论活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示ISG15的表达可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性显著相关。

ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备

通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。

MDCK细胞ISG15基因的克隆表达及抗病毒活性分析

为了解ISG15基因体外抗病毒机制,应用RT-PCR方法扩增了MDCK细胞的ISG15基因,经测序分析,该基因序列与Gen Bank中登录的犬属ISG15基因序列相似性为99%。将该基因亚克隆至p ET-28a载体构建出重组原核表达质粒p28a-M15;工程菌p28a-M15/BL21经IPTG诱导表达,获得了约22 k D的重组目的蛋白,重组蛋白经Ni2+柱层析纯化。于H9N2亚型禽流感病毒S2株感染前后在MDCK细胞中定量加入纯化的ISG15蛋白,结果显示,病毒感染MDCK细胞前加入ISG15蛋白可以抑制病毒的复制,但病毒感染后添加该蛋白则促进了病毒的复制。

PK-15细胞的ISG15基因敲除促进PRV的复制

本试验旨在研究干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。通过CRISPR/Cas9技术构建猪ISG 15基因敲除猪肾上皮(PK-15)细胞系,利用CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ISG 15基因对细胞活力的影响,采用间接免疫荧光技术检测PK-15以及PK15-ISG15-/-细胞感染PRV的增殖差异,通过RT-qPCR检测PRV-EP 0、PRV-gE、PRV-VP 16和IFN-β的转录水平,Western blot检测PRV-gE和ISG15的蛋白表达水平,以及通过病毒噬斑检测对子代病毒感染力的影响。结果表明,sgRNA1和sgRNA2均成功敲除ISG 15基因;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,敲除ISG 15基因对PK-15细胞活力无影响;间接免疫荧光检测结果表明,PRV感染后,PK15-ISG15-/-细胞中的荧光强度明显高于PK-15细胞;RT-qPCR和Western blot结果表明,敲除ISG 15可以促进PRV的转录和蛋白表达;病毒噬斑试验进一步显示,敲除ISG 15可以促进PRV的复制。另外,RT-qPCR结果显示,敲除ISG 15可以抑制PRV感染引起的IFN-β转录上调。本研究成功构建了PK15-ISG15-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实ISG 15基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖,并推测这种抑制作用可能与IFN通路有关。

ISG15和OAS1在奶牛早期妊娠阶段外周血中的表达规律

本研究旨在揭示干扰素刺激基因ISG15和OAS1在中国荷斯坦奶牛早期妊娠阶段外周血中的表达规律,为利用干扰素刺激基因进行早期妊娠诊断提供理论和方法上的指导。试验用青年母牛共27头,其中自然发情牛10头,同期发情牛17头;人工授精后0、14、18、21和28d采集外周血并分离总白细胞或白细胞亚类(淋巴细胞、单核细胞、NK细胞);采用荧光定量PCR检测ISG15和OAS1的相对表达量。结果表明:人工授精后18d妊娠牛外周血中ISG15和OAS1的相对表达量均显著高于空怀牛;ISG15在妊娠牛中一致上调(平均3.92倍),空怀牛中一致下调(平均1.46倍);OAS1在妊娠牛中平均上调3.49倍,空怀牛平均下调1.28倍。自然发情条件下,妊娠牛外周血中ISG15和OAS1的相对表达量均显著高于空怀牛,同期发情条件下两个基因在表达趋势上与之类似,但差异不显著;进一步分析显示:人工授精后18dOAS1在妊娠牛淋巴细胞中的表达显著高于空怀牛,其中妊娠牛中OAS1一致上调表达,平均上调2.14倍,空怀牛中OAS1一致下调,平均下调1.80倍。研究提示:人工授精后第18天妊娠牛与空怀牛之间ISG15的差异表达比OAS1更明显;自然发情状态下,妊娠牛与空怀牛之间两个基因差异表达情况比同期发情状态下更明显;相对于外周血总白细胞,妊娠牛与空怀牛外周血淋巴细胞中ISG15、OAS1的差异表达倍数更低。综上表明,利用外周血中ISG15的表达水平可望能够在人工授精后18d对自然发情奶牛较为准确地做出早期妊娠诊断;对于ISG15、OAS1在外周血免疫细胞亚类中的表达分析,为深入研究奶牛早期妊娠识别的分子机制奠定了基础。