ISG15蛋白促进猪源牛病毒性腹泻病毒2型对Ⅰ型IFN表达抑制的研究

为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。

牛源ISG15蛋白的原核表达及抗血清的制备

本研究利用人重组干扰素IFNα-2A刺激牛肾细胞(Mardin-Darby bovine kidney cells,MDBK),并提取细胞总RNA。RT-PCR扩增牛源干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG 15),将其克隆入p Cold-TF表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达后,获得约70 k Da可溶性ISG15重组蛋白。用试剂盒对重组蛋白ISG15进行纯化回收,经BCA法测定其蛋白浓度为1 mg/m L。用纯化的ISG15重组蛋白免疫ICR小鼠,制备多克隆抗体血清,用间接ELISA方法测定多抗血清效价为1:102 400。利用Western blot进一步鉴定ISG15多抗血清,结果发现其与纯化的ISG15重组蛋白能发生特异性反应,可用于后续研究。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ISG15 mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ISG15 mRNA表达及其与疾病活动性的关系。方法采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测89例SLE患者(活动期50例、缓解期39例)、结缔组织病(CTD)患者34例(疾病对照组)、健康体检者35名(健康对照组)外周血PBMCs中ISG15 mRNA的表达水平和含量。以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的变化。结果活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于缓解期SLE患者(ΔCt=5.48±1.72,t=11.572,P<0.01);活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于疾病对照组(ΔCt=5.90±1.72,t=12.69,P<0.01)和正常对照组(ΔCt=5.66±1.63,t=12.359,P<0.01);缓解期SLE患者ISG15 mRNA表达水平与正常人及疾病对照组的差异无显著性(P>0.05)。SLE患者PBMCs中ISG15 mRNA的表达水平与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)评分及抗双链DNA抗体呈显著正相关(均P<0.01),与补体C3、C4呈显著负相关(均P<0.01)。结论活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示ISG15的表达可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性显著相关。

ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备

通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。

泛素样蛋白ISG15抗冠状病毒感染作用的研究进展

干扰素刺激基因15(ISG15,interferon-stimulated gene 15)是一种泛素样蛋白,在调节机体天然免疫和抗病毒感染过程中发挥重要作用。ISG15在针对流感病毒、乙型肝炎病毒、HIV病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、巨细胞病毒等病毒的抗病毒研究已有文献报道。除此以外,最新的研究表明ISG15分子会在新型冠状病毒的木瓜蛋白酶样蛋白酶的作用下失活,从而抑制其抗病毒功能。因此抑制新型冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶,除能直接阻断病毒的生命周期、抑制病毒在体内的复制以外,同时也会提升ISG15分子水平,继而间接提升机体免疫能力,降低感染风险。该文介绍ISG15抗新冠病毒的过程,重点介绍ISG15抗冠状病毒作用的特异性,此外,总结新冠病毒通过木瓜蛋白酶样蛋白酶阻断ISG15介导的天然免疫实现免疫逃避的机制,并罗列了潜在的木瓜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。本文从ISG15抗病毒天然免疫的分子机制角度,总结抗SARS-CoV-2药物的最新进展,并对相关药物的研发前景进行展望。

SARS冠状病毒非结构蛋白质NSP3突变体构建及其对类泛素分子DUB活性

SARS冠状病毒(SARS-CoV)非结构蛋白NSP3编码的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)对泛素样分子(Ubl)具有去泛素化酶(DUB)活性,但目前有关NSP3 DUB活性研究的报道甚少.本研究构建包含Nsp3基因N末端不同结构域的突变体,并检测NSP3及其一系列突变体对类泛素分子ISG15和SUMO所修饰蛋白质分子的作用特性.实验结果表明,NSP3及其突变体NSP3AD,NSP3AE,NSP3AF具有一定的去ISG15活性,而其突变体NSP3AC则没有去ISG15(DeISGylation)活性.研究结果提示,SARS NSP3具有一定的体内去ISG15活性,并且这种活性主要依赖于Nsp3基因编码的PLpro.但SARS NSP3及其突变体NSP3AC,NSP3AD,NSP3AE和NSP3AF并不具有去SUMO(DeSUMOylation)活性.SARS冠状病毒NSP3对类泛素样分子作用特性的研究为后续NSP3的生物学特性及其对干扰素通路的调控研究奠定了基础.

姜黄素对黑素的抑制作用及机制

目的姜黄素调节B16F10细胞微环境影响黑素合成的机制研究。方法(1)不同浓度姜黄素分别作用于B16F10及HaCaT细胞,MTT法检测该两种细胞活力;NaOH裂解法检测B16F10细胞黑素含量;L-DOPA氧化法检测B16F10细胞酪氨酸酶活性;Western blot法检测B16F10细胞黑素生成(gp100、Mitf、GPNMB、Tyr、TRP2)及转运(Rab27a)关键蛋白表达水平;HaCaT细胞:ISG15蛋白表达水平。(2)不同浓度ISG15作用于B16F10细胞,NaOH裂解法检测黑素含量;L-DOPA氧化法检测酪氨酸酶活性;结果姜黄素在一定浓度范围内,直接抑制酪氨酸酶活性及黑素生成,且抑制黑素细胞迁移;ISG15蛋白作用于黑素细胞,明显促进gp100蛋白表达,酪氨酸酶活力,黑素含量。姜黄素抑制HaCaT细胞ISG15蛋白表达,改变黑素细胞微环境,通过ISG15间接发挥抑制黑素合成作用。结论姜黄素除直接抑制黑素合成外,还可以通过抑制ISG15蛋白的表达,改变黑素细胞微环境,间接发挥抑制黑素合成作用。

干扰素刺激基因15抗病毒免疫研究进展

干扰素刺激基因15(ISG15)蛋白是由干扰素或病原体刺激产生的泛素样蛋白。ISG15能够通过酶促级联反应与靶蛋白共价结合形成ISGylation,称为ISG化。ISG15在干扰素诱导的抗病毒免疫应答过程中发挥重要作用。研究发现,ISG15对多种病毒均具有抗病毒活性。此外,ISG15在细胞自噬、宿主损伤、DNA修复、蛋白翻译等过程中也具有重要作用。论文通过对近年来国内外学者在ISG15类泛素修饰系统、抗病毒免疫分子机制以及ISG15单体生物学功能等方面取得的研究进展进行综述,以期为ISG15抗病毒免疫研究和抗病毒药物的研制提供参考。

宿主细胞干扰素刺激基因15蛋白的真核表达及初步应用

为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。

类泛素蛋白ISG15及其共价酶修饰系统与肿瘤

干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)编码的ISG15蛋白是最早发现的类泛素修饰蛋白。不仅干扰素和病毒感染能诱导该基因的表达,一些抗肿瘤药物也能刺激ISG15的表达。近年来,ISG15及其修饰系统与肿瘤的关系备受关注。研究证实,ISG15的激活酶E1即UBE1L与某些肿瘤的抑制有关,而其他一些成分如ISG15解聚酶UBP43则与肿瘤发生发展有关。此外,ISG15高表达与肿瘤的转移有关,ISG15对化疗药物的敏感性也有影响。本文较为全面地阐述ISG15及其修饰系统在肿瘤抑制或发生发展中的生物学作用,这将增强对ISG15与肿瘤关系的基础性认识,并为发展新的肿瘤靶向性治疗提供理论依据。