ISG15蛋白促进猪源牛病毒性腹泻病毒2型对Ⅰ型IFN表达抑制的研究

为研究ISG15蛋白与猪源牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)相互作用关系,本研究通过RT-PCR扩增ISG15基因并克隆于真核表达载体p EC129中,转染于MDBK细胞,经G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的细胞系E53。将猪源BVDV-2分别感染E53细胞和MDBK细胞,收集不同时间点的细胞培养液并测定病毒的TCID50。结果显示ISG15蛋白对猪源BVDV-2复制具有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测猪源BVDV-2感染E53细胞内ISG15基因表达的变化,结果表明,病毒感染的E53细胞内ISG15基因的表达量明显高于对照组,表明猪源BVDV-2感染能够显著提高ISG15基因的表达。此外,利用荧光定量PCR检测经poly I:C处理后感染SH-28株的MDBK和E53细胞内IFN-α和IFN-β表达情况。结果表明MDBK细胞内IFN-α和IFN-β表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,表明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对Ⅰ型IFN的抑制作用。本实验为进一步研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。

ISG15蛋白泛素结合酶UBCH6的原核表达及多克隆抗体制备

通过抽提接毒猪瘟病毒(CSFV)的PK-15细胞RNA,以RT-PCR方法克隆UBCH6基因,并与pMD18-T载体连接,再通过双酶切法将UBCH6基因与原核表达载体pGEX-4T-1、真核表达载体pcDNA3.0连接。重组原核表达载体pGEX-UBCH6用感受态细胞BL21转化,并在低温条件下,用低浓度的IPTG诱导表达UBCH6重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示,在30℃、用0.05 mmol/L IPTG诱导时UBCH6表达效果最好,而且UBCH6重组蛋白主要以可溶性的形式在菌液中表达。UBCH6重组蛋白经过Ni-NTA纯化后与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合乳化并免疫4周龄昆明小鼠,从而制备出UBCH6多克隆抗体,重组真核表达载体pcDNA3.0-UBCH6以化学转染人工脂质体法导入293T细胞中,Western blot检测制备的UBCH6多克隆抗体能与真核表达细胞蛋白发生反应,反应效价可达1∶10000,反应性良好。Western blot检测UBCH6多克隆抗体的特异性,ISG15多克隆抗体、UBCH6多克隆抗体都能与接毒CSFV、转染PolyI:C的PK-15细胞蛋白发生良好反应,且蛋白表达量与时间呈正相关。

泛素样蛋白ISG15抗冠状病毒感染作用的研究进展

干扰素刺激基因15(ISG15,interferon-stimulated gene 15)是一种泛素样蛋白,在调节机体天然免疫和抗病毒感染过程中发挥重要作用。ISG15在针对流感病毒、乙型肝炎病毒、HIV病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、巨细胞病毒等病毒的抗病毒研究已有文献报道。除此以外,最新的研究表明ISG15分子会在新型冠状病毒的木瓜蛋白酶样蛋白酶的作用下失活,从而抑制其抗病毒功能。因此抑制新型冠状病毒木瓜蛋白酶样蛋白酶,除能直接阻断病毒的生命周期、抑制病毒在体内的复制以外,同时也会提升ISG15分子水平,继而间接提升机体免疫能力,降低感染风险。该文介绍ISG15抗新冠病毒的过程,重点介绍ISG15抗冠状病毒作用的特异性,此外,总结新冠病毒通过木瓜蛋白酶样蛋白酶阻断ISG15介导的天然免疫实现免疫逃避的机制,并罗列了潜在的木瓜蛋白酶样蛋白酶的抑制剂。本文从ISG15抗病毒天然免疫的分子机制角度,总结抗SARS-CoV-2药物的最新进展,并对相关药物的研发前景进行展望。

类泛素蛋白ISG15调控感染与肿瘤的新进展

IFN刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)编码的蛋白ISG15是最早被发现的一种类泛素蛋白,在生物体内以单体和复合体形式存在。和泛素一样,ISG15的单体和其共价修饰的蛋白参与并调节了复杂的生物学过程。在病毒、细菌感染以及肿瘤发生过程中,ISG15单体和底物蛋白的共价修饰水平均出现不同程度改变,这表明ISG15在固有免疫的调控中发挥重要作用。越来越多的研究表明ISG15和其共价修饰系统已成为疾病预防和治疗的重要靶点。文章介绍了ISG15的发现、结构特点以及其共价修饰系统,并阐述了近年来ISG15在抗病毒、抗菌和肿瘤发生过程中的重要作用。

姜黄素对黑素的抑制作用及机制

目的姜黄素调节B16F10细胞微环境影响黑素合成的机制研究。方法(1)不同浓度姜黄素分别作用于B16F10及HaCaT细胞,MTT法检测该两种细胞活力;NaOH裂解法检测B16F10细胞黑素含量;L-DOPA氧化法检测B16F10细胞酪氨酸酶活性;Western blot法检测B16F10细胞黑素生成(gp100、Mitf、GPNMB、Tyr、TRP2)及转运(Rab27a)关键蛋白表达水平;HaCaT细胞:ISG15蛋白表达水平。(2)不同浓度ISG15作用于B16F10细胞,NaOH裂解法检测黑素含量;L-DOPA氧化法检测酪氨酸酶活性;结果姜黄素在一定浓度范围内,直接抑制酪氨酸酶活性及黑素生成,且抑制黑素细胞迁移;ISG15蛋白作用于黑素细胞,明显促进gp100蛋白表达,酪氨酸酶活力,黑素含量。姜黄素抑制HaCaT细胞ISG15蛋白表达,改变黑素细胞微环境,通过ISG15间接发挥抑制黑素合成作用。结论姜黄素除直接抑制黑素合成外,还可以通过抑制ISG15蛋白的表达,改变黑素细胞微环境,间接发挥抑制黑素合成作用。

IFN-I通路中的ISG15、USP18及MxA表达在特发性炎性肌病中的研究

皮肌炎本质上属于一种自身免疫性疾病,主要是由于免疫功能紊乱而导致的。通常情况下,主要表现为对称性四肢近端肌无力,与此同时,还可能出现骨骼肌以及皮肤损害的情况。近年来研究发现,Ⅰ型干扰素介导的相关信号通路在皮肌炎的发病中具有重要意义,其中以ISG15、USP18及MxA通路蛋白的表达在皮肌炎发病中所起的作用正在成为新的研究方向。本文对Ⅰ型干扰素的产生、Ⅰ型干扰素在JAK/STATs通路中的作用机制、Ⅰ型干扰素下游的表达产物ISG15、USP18及MxA等,在皮肌炎发病中的作用进行综述。