结合流式细胞仪检测技术的菌体原位PCR扩增

建立一套原位PCR检测方法 ,联合流式细胞仪作为检测工具 ,作为基因水平转移研究中的基因监控手段。通过常规PCR反应以确定靶基因的基本扩增参数 ;细菌菌体经过多聚甲醛PBS液固定和溶菌酶处理后进行原位PCR扩增 ,产物洗涤后迅速用流式细胞仪进行荧光检测 ,并辅以荧光显微镜镜检。扩增样品在荧光显微镜的蓝光激发下发出明亮的黄绿色荧光 ,与空白对照中的无扩增菌体的自发荧光可明显区分。流式细胞仪检测结果也显示 ,阴性菌与阳性菌的荧光强度有明显区别。完成了对目标细菌的原位PCR扩增 ,并成功地应用流式细胞仪对原位PCR扩增菌体实施了检测。由此表明isPCR

原位聚合酶链反应及其在眼科的应用

原位ＰＣＲ是一种能在组织细胞原位对目的基因进行扩增，用原位杂交技术进行定性、定量和定位研究的技术。它是ＰＣＲ和原位杂交结合的产物，具有高度敏感性、特异性，并能在细胞形态学上准确定位的特点。

环氧合酶-2在食管癌、胃癌、贲门癌的表达比较

目的 研究环氧合酶2(Cox 2)蛋白及其mRNA在食管癌、胃癌、贲门癌中的表达量和细胞内定位的异同,探讨Cox 2抑制剂对贲门癌的预防作用。方法 免疫组化法定量检测了3 种肿瘤共48 例标本的Cox 2 蛋白,RT PCR法和原位PCR法检测了其中29 例标本的Cox 2mRNA及其在组织细胞内的定位。结果 食管癌、胃癌、贲门癌的Cox 2染色分数分别为4.15±1.39, 3.66±1.16, 2.93±1.03,均高于正常组织。贲门癌的染色分数与胃癌的无显著性差异。Cox 2mRNA在贲门癌的检出率为87.5%(ISPCR),75%(RT PCR),在胃癌、食管癌的检出率为100%,无显著性差异。Cox 2mRNA位于癌细胞胞浆,胞核中也有少量存在,其在3 种肿瘤中相同。结论 Cox 2 在贲门癌中显著升高,其表达特点与胃癌、食管癌中基本相同。Cox 2抑制剂对贲门癌可能有预防作用。

正常角膜上皮细胞单纯疱疹I型病毒潜伏的研究

目的 检测近视眼患者角膜上皮细胞单纯疱疹I型病毒 (HSV I) ,探讨其在正常角膜潜伏的可能性。方法 取行准分子激光屈光性角膜切削术 (PRK)的近视眼角膜上皮细胞 13 8份 (13 8眼 ) ,每份均匀分为三部分 ,两份分别行HSV I的原位聚合酶链反应 (ISPCR)检测和间接免疫荧光法 (IFA)检测 ,阳性者取其相对应的第 3份角膜上皮进行病毒分离培养和电镜观察。结果 13 8份近视眼角膜上皮中 ,ISPCR阳性者 8眼 (5 8% ) ,IFA阳性者 4眼 (2 9% ) ,两种检测均阳性者 3眼 (2 2 % ) ,取此 9眼的第 3份角膜上皮进行病毒分离培养 ,电镜扫描未发现病毒颗粒。结论 正常角膜上皮细胞内存有HSV I功能基因 ,提示可能有HSV

胃癌组织中HPV16与幽门螺杆菌感染相关性研究(英文)

目的:研究胃癌组织中人类乳头瘤病毒16型(HPV16)感染与幽门螺杆菌感染之间的相关性。方法:运用原位PCR和免疫组化技术分别检测陕西省地区胃癌组织中HPV16癌基因E6和幽门螺杆菌(Hp)。结果:在40例胃癌组织(GC)中HPV16E6的阳性率为27.5%(11/40)而在40例癌旁正常组织(GANM)中未检测到;GC组中HPV16E6阳性率明显高于GANM组(P=0.0004);贲门癌中HPV16的感染率明显高于非贲门癌(P=0.0136);胃癌中HPV16与幽门螺杆菌感染无明显相关性(P=0.0829)。HPV16与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤浸润、淋巴结转移以及病理分级均无明显相关性(P>0.05)。结论:本研究结果提示,在胃癌的发生过程中,HPV16可能不依赖或者不与幽门螺杆菌协作而发挥作用。

HBV感染者胎盘组织HBV ccc DNA检测

目的建立HBV ccc DNA在胎盘组织中定性及定位检测方法,了解慢性HBV感染者胎盘组织中HBV ccc DNA的存在状况,进一步探讨其意义及乙型肝炎病毒母婴传播机制。方法选取首都医科大学北京地坛医院慢性乙型肝炎病毒感染者孕晚期胎盘组织40例,阳性对照肝组织标本3例,阴性对照为健康足月妊娠产妇胎盘标本,共5例。所有胎盘标本均分两份,分别于-80℃冷冻和福尔马林室温浸泡保存。冷冻标本采用质粒抽提法提取胎盘组织中HBV ccc DNA,液相PCR定性检测;福尔马林处理标本作石蜡切片,用于原位PCR定位检测。结果 40例标本中,液相PCR检测出HBV ccc DNA阳性者8例,其相应的血清HBV DNA均>105拷贝/ml。取该8例及另2例乙型肝炎患者孕晚期胎盘石蜡切片经HBV ccc DNA原位扩增,7例检测出HBV ccc DNA阳性,胎盘绒毛毛细血管内皮细胞、绒毛合体滋养层细胞、PBMC等多种细胞均存在HBV ccc DNA阳性信号。结论研究表明,胎盘组织HBV感染与孕妇血液中HBV DNA含量显著相关。胎盘组织的HBV ccc DNA原位PCR检测显示,HBV可感染胎盘各层细胞。羊膜上皮细胞中也发现HBV ccc DNA阳性信号。胎盘组织感染的HBV及其在这些细胞中的复制是否直接与HBV宫内感染相关尚需进一步研究。

原位PCR及其在海洋细菌检测中的应用

原位PCR技术在海洋生物研究中应用较少,尚无规范的方法步骤。将原位PCR技术应用于海洋细菌功能基因检测,通过实践探讨了影响原位PCR的关键因素,指出细胞的固定和消化是影响其成败的关键;探讨了有关的实验条件;并展望了在检测海洋细菌,尤其是对目前尚无合适方法定量检测的典型海洋功能细菌等的检测方面,原位PCR有望发挥重要作用。

检测组织石蜡切片中猪圆环病毒2型间接原位PCR方法的建立与评估

利用PCR的高灵敏度和原位杂交(ISH)的细胞定位能力,建立了一种间接原位PCR(ISPCR)方法用来检测经福尔马林固定的腹股沟淋巴结的石蜡切片中的猪圆环病毒2型(PCV2)的分布,这些腹股沟淋巴结来自于携带猪圆环病毒2型的临床健康猪及患有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪。间接ISPCR与其他几种常规PCV2诊断方法敏感度比较结果显示:套式PCR方法最为敏感,其次是间接ISPCR、常规PCR、ISH与免疫组织化学(IHC)染色方法。尽管间接ISPCR、ISH和IHC染色方法均能显示出相似的PCV2信号分布图,但是间接ISPCR可以显示出先前用常规ISH或ICH染色方法未能显示出来的PCV2信号,尤其在携带PCV2的临床健康猪的生发中心细胞中。而且6种不同的PCV2信号表达模式与相关淋巴组织病变可被分级用来描述组织形态学变化和病毒感染。研究结果表明:间接ISPCR是一种效果较为显著的基于细胞的诊断工具,它具有在福尔马林中固定并经石蜡包埋的组织切片中诊断PCV2的特异性,它将是深入研究PCV2发病机理的有效工具。

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。

应用原位PCR技术检测宫颈癌和宫颈上皮内瘤变组织中人乳头瘤病毒DNA

目的 探讨原位PCR(isPCR)技术的敏感性及人乳头瘤病毒 (HPV)与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变 (CIN)的关系。方法 采用isPCR技术对 66例宫颈癌和 2 5例CIN组织中的人乳头瘤病毒 (HPV)DNA进行检测。结果 5 2例宫颈癌检测到了HPVDNA ( 78.8% ) ,其中HPV16DNA阳性 4 5例( 78.8% ) ,HPV18DNA阳性 10例 ( 15 .2 % ) ,HPV16、18的DNA均阳性 3例 ,HPV18DNA阳性而HPV16DNA阴性 7例 ,CIN中HPVDNA阳性 13例。结论 isPCR是一种敏感性高、特异性强的方法 ;宫颈癌和CIN的发生与HPV16和HPV 18感染有密切关系。

原位PCR技术检测石蜡包埋肝组织中HBV DNA

采用原位PCR技术对22例石蜡包埋肝组织中HBV DNA进行检测,并与提取组织DNA PCR技术及原位杂交技术进行比较。结果表明,22例标本经原位PCR检测有9例为阳性;经提取组织DNA PCR检测有7例阳性,两者敏感性相近,符合率达80％;经原位杂交检测有4例阳性,其敏感性只及原位PCR的44％。提示原位PCR是项快速、敏感及特异性较高的检测技术。

原位聚合酶链反应检测角膜组织中HSV-1型DNA

为研究单纯疱疹病毒Ⅰ型（ＨＶＳ－Ⅰ）在角膜内的潜伏感染情况。采用原位聚合酶链反应（ＩＳＰＣＲ）定位检测２１例角膜标本中的ＨＳＶ－Ⅰ，其中７例活动期ＨＳＫ，１３例静止期ＨＳＫ，１例圆锥角膜。结论：在ＨＳＫ活动期及静止期中，角膜各层细胞内均有ＨＳＶ－Ⅰ的存在。