五针松胚乳ISSR—PCR反应体系的建立

采用改良的CTAB法提取 5种五针松胚乳DNA ,经检测 ,该方法提取的DNA纯度和含量较高 ,单粒种子胚乳DNA得率基本满足大量PCR扩增的需要。建立了稳定的、可重复的五针松ISSR—PCR最佳反应体系及PCR扩增程序 ,筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的 1 6个ISSR引物 ,为今后利用五针松种子胚乳开展遗传图谱构建等分子生物学研究提供一个标准化程序。

杉木ISSR—PCR反应体系的正交优化

利用正交设计实验对影响杉木ISSR-PCR扩增的重要因素（Mg^2＋、dNTP、模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化,以建立杉木ISSR-PCR反应的最佳体系。结果发现杉木ISSR-PCR最佳反应体系（20μL）为：MgCl21.8 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.7μmol/L,模板DNA 90 ng,TaqDNA聚合酶1 U;退火温度为52-55℃。扩增反应程序为：94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52℃退火40 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。该反应体系的建立,为杉木种质资源分类、遗传多样性分析提供了更客观可靠的方法。

皂荚ISSR-PCR反应体系的建立与优化

建立皂荚ISSR-PCR反应体系,为皂荚遗传多样性分析、种质资源鉴定提供技术支持,以皂荚DNA为模板,对影响PCR扩增反应的4个因素(模板DNA浓度、引物浓度、Master Mix用量、PCR反应循环数)设置6个梯度并从3个水平上进行单因素优化,后采用L 9(34)正交设计,对各处理组合进行电泳检测后进行评分,对评分结果进行极差分析和方差分析,从而筛选出皂荚最佳的ISSR-PCR反应体系和扩增程序以及得出各因素对反应体系的影响程度。通过设置不同的退火温度,利用优化后的皂荚ISSR-PCR反应体系及扩增程序对已公布的100条ISSR通用引物进行筛选。研究结果表明,皂荚ISSR-PCR最佳反应体系为:在25μL的反应体系中,DNA模板浓度35 ng,引物浓度5μmol/L,Master Mix用量12μL,30个循环;各因素影响大小依次是:DNA模板浓度>Master Mix用量>引物浓度>PCR反应循环数。最后在该体系下共筛选出了22条条带清晰、多态性好的引物。

党参基因组DNA提取、ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

对党参基因组DNA提取方法优化、ISSR体系形成及引物筛选三方面进行探讨,为研究党参居群遗传多样性及药材DNA鉴定奠定基础。经比较改良CTAB法、改进的高盐SDS法和试剂盒三种常用DNA提取方法,发现改良CTAB法效果最佳;利用优化设计并结合有关文献优化ISSR反应体系,最优反应体系为:50μL总反应体积中含约20ng DNA模板,1.25UTaq DNA聚合酶,2.25mmol.L-1Mg2+,200μmol.L-1dNTP,0.50μmol.L-1引物。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。

珍稀濒危植物大果木莲ISSR-PCR反应体系的建立

[目的]建立高效稳定的大果木莲ISSR-PCR反应体系。[方法]以珍稀濒危植物大果木莲新鲜嫩叶为材料,在高盐沉淀法提取高质量基因组DNA的基础上,通过ISSR-PCR反应体系中5个主要因素的单因子梯度试验,优化并最终建立了大果木莲稳定而高效的ISSR-PCR反应体系和反应程序。[结果]试验建立的大果木莲的ISSR-PCR反应体系为:20.0μl反应体系中含10×buffer2.0μl、Mg2+2.0 mmol/L、Taq酶0.5 U、DNA模板40 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs0.2 mmol/L和ddH2O13.3μl,其反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,50～60℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃完全延伸7 min。[结论]该研究为进一步揭示大果木莲群体的遗传多样性和遗传结构状况以及制定科学的保护措施提供了理论依据。

黔产苦参ISSR-PCR反应体系正交优化研究

[目的]确定适合苦参稳定的ISSR-PCR反应体系。[方法]采用经典的CTAB法提取苦参新鲜幼嫩叶片DNA;针对Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶进行正交设计L_(16)(4~5),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系。[结果]最适ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 90 ng、0.4μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg^(2+)、TaqDNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L d NTPs。[结论]建立的苦参ISSR-PCR反应体系,经过19份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析。

蒜头果ISSR-PCR反应体系建立及验证

【目的】建立稳定的蒜头果ISSR-PCR反应体系,筛选出适用于蒜头果的多态性引物,为后续蒜头果遗传多样性研究及种质资源保护提供参考依据。【方法】采用单因素试验与L25(54)正交试验相结合的方法,对影响ISSR-PCR反应体系扩增效果的4个主要因素(模板DNA用量、引物浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶)及反应循环数进行优化,确定最佳反应体系和条件。在此基础上筛选出适用于蒜头果的多态性引物,探究其最佳退火温度,并采集云南省境内3个野生居群10个蒜头果样品对优化的反应体系进行验证。【结果】蒜头果ISSR-PCR最佳反应体系(20.0μL):模板DNA 30 ng,ISSR引物0.3μmol/L,d NTPs 0.250 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.00 U,dd H2O补足至20.0μL。ISSR最佳反应程序为30个循环。利用优化后的反应体系筛选出了8条引物(UBC825、UBC826、UBC827、UBC836、UBC844、UBC861、UBC834和UBC851)的最佳退火温度,分别为50.2、56.5、50.2、56.5、50.2、50.2、50.2和54.0℃,部分引物(如UBC827、UBC836、UBC861等)实测最佳退火温度与软件预测退火温度存在明显差异。采用优化后的ISSR-PCR反应体系及引物对10个蒜头果样品进行ISSR-PCR分子标记检测,结果显示建立的ISSR-PCR反应体系稳定可靠,不同采样点的蒜头果在遗传上相对保守,且10个蒜头果样品的遗传分化系数(Gst)为0.74,说明其74%的遗传多样性存在于居群间,且基因流(N_(m))为0.18,远小于1.00,说明发生遗传漂变的概率大,易发生遗传多样性降低及居群分化。【结论】通过优化蒜头果ISSR-PCR反应体系,建立可用于蒜头果ISSR-PCR分子标记扩增的稳定反应体系,可用于蒜头果种质资源保护与利用研究工作。

散斑壳属ISSR-PCR反应条件的优化

以散斑壳属(Lophodermium)T29、T50、T62、R111菌株为研究材料,对该属ISSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶浓度以及退火温度等条件进行优化,寻找出适合此类真菌ISSR-PCR反应的最佳反应体系为15μL反应体系中,模板DNA浓度为4～8ng/μL、引物浓度0.4～0.5μmol/L、Mg2+浓度2.0～2.5mmol/L、dNTPs浓度0.15～0.30mmol/L、TaqDNA聚合酶量1.5～2.5U,退火温度为52℃。

山豆根ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

以山豆根为试验材料,采用正交试验考察DNA、引物、Mg^(2+)、dNTPs、Taq酶5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响,建立并优化山豆根ISSR-PCR反应体系条件。结果表明:山豆根ISSR-PCR反应体系(20μL)最优条件为Mg^(2+)浓度3 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1 U,引物0.5μmol/L,模板DNA 100 ng,运用该体系从100条UBC引物中筛选到10条清晰、多态性好的引物。采用正交试验设计可有效建立山豆根ISSR-PCR反应的最优体系,为山豆根的亲缘关系,种质资源遗传多样性评价及品种鉴定和系统分类等研究提供科学依据。

利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对水曲柳ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在4个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件MINITAB分析:①各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;②筛选出各反应因素的最佳水平,建立水曲柳ISSR-PCR反应的最佳体系(20滋l)为:Taq酶1.0U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA50￣200ng,dNTP0.15mmol/L,引物0.3滋mol/L。最后,对水曲柳ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为58.3℃。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术,研究水曲柳的地理变异提供一个标准化程序。

珍稀濒危植物五小叶槭ISSR-PCR反应体系的建立和优化

五小叶槭为珍稀濒危植物,在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面具有重要的科学价值。本研究采用2XTaqMaster Mix,综合考虑Taq酶、Mg^(2+)和d NTPs,对影响五小叶槭ISSR-PCR反应的3个因素(DNA模板、引物和Master Mix)进行3水平正交试验,从而优化出五小叶槭ISSR-PCR反应最佳体系。结果表明,引物用量对反应结果影响最大,其次为DNA模板,2XTaqMaster Mix对反应结果影响最小。最佳反应体系(25μL)为:DNA模板(50 ng·μL^(-1))1μL,引物2μL,2XTaqMaster Mix 13. 5μL。

广西甜茶ISSR-PCR反应条件的建立与优化

为了探讨广西甜茶ISSR实验中的多种因素对实验结果的影响,采用单因素法对PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+,dNTP,引物,Taq酶和模板DNA)在5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度和循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为,1×PCR Buffer、MgCl22.0mmol/L、dNTP0.2mmol/L、引物0.8μmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、模板DNA 80ng;最佳反应程序为:在94℃下进行3min预变性;随后循环扩增35次(包括94℃变性1min,54℃退火1min,72℃延伸1min);最后在72℃下延伸10min。本研究建立的广西甜茶的最佳ISSR-PCR反应条件为进一步进行遗传多样性研究奠定了基础。

乌拉尔甘草ISSR-PCR反应体系优化研究

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR+PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2+),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。

橄榄ISSR-PCR反应体系的优化

采用正交设计和单因素试验,以BDB(CA)7为引物,对ISSR-PCR扩增橄榄基因组DNA的主要影响因子进行了筛选和分析,优化了适宜于橄榄ISSR-PCR的扩增体系。结果表明,20μL的反应体系中采用40ng的模板DNA,0.2mmol/LdNTPs,0.25μmol/LISSR引物、1UTaq聚合酶,以及51.6℃-53℃的复性温度为橄榄ISSR-PCR扩增的最优条件。

龙眼ISSR-PCR反应体系的优化及指纹图谱初探

以立冬本龙眼DNA为模板研究了龙眼ISSR-PCR反应体系的主要成分对ISSR扩增结果的影响,并探讨了构建龙眼指纹图谱的可行性。结果表明:在25μL的PCR反应体系中Mg2+的最适浓度为2.0 mmol.L-1;dNTP最适浓度为0.2 mmol.L-1;引物的最适浓度为0.7μmol.L-1;模板20 ng;Taq DNA聚合酶用量为1.5 U。利用优化后的反应体系对福建不同地区龙眼基因型进行了ISSR扩增,扩增产物在250 bp^2 kb;利用丰富的多态性DNA谱带构建了12个基因型龙眼的指纹图谱。

葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系的建立与优化

【目的】建立并优化葡萄种质资源稳定的ISSR-PCR体系,为葡萄种质资源研究和种质创新奠定基础。【方法】以新疆22个葡萄种质资源叶片为材料,采用改良CTAB法提取葡萄基因组DNA,并利用单因素法对影响ISSR反应体系中的各个影响因子进行优化。【结果】优化的最佳ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 30 ng,dNTPs 0.3 mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,反应体系为25.0μL。【结论】优化了新疆葡萄种质资源ISSR-PCR反应体系中的各个影响因子,利用该体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可以用于葡萄种质资源遗传多样性分析。

石蒜属植物种质资源ISSR-PCR反应体系的建立

为进一步开展石蒜属Lycoris植物种质资源遗传多样性研究,利用正交试验设计的方法,从Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物等5因素4水平,对石蒜属植物ISSR(intersimple sequence repeats)反应体系进行优化,确立了石蒜属植物ISSR的最佳反应体系:在20μL反应体系中,含1×Buffer,模板DNA 50 ng,2.5 mmol.L-1氯化镁(MgCl2),0.15 mmol.L-1dNTP,25.05 nkatTaq聚合酶,0.5μmol.L-1引物。进一步进行梯度退火试验,确定最适宜退火温度为57℃。

杜仲ISSR-PCR反应体系的建立与引物筛选及其在遗传多样性研究中的应用

为了探究杜仲多居群的遗传多样性,通过开展正交试验,建立了适合杜仲的ISSR-PCR反应体系,筛选出了14条多态性较高的有效引物,分析了杜仲的遗传多样性;共扩增出108个多态性位点,多态性位点的百分率为100%,有效等位基因数ne为1.505,Nei’s期望杂合度He为0.308,Shannon多态性的信息指数I为0.472。文中初步揭示出杜仲具有较高的遗传多样性,试验结果表明了ISSRs标记技术适用于杜仲的遗传多样性研究。

柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25μl总体积中含有1×Taq酶缓冲液，2．0mmol／L MgCl2，各0．15mmol／L的dNTPs，0．3μmol／L引物，1．5U Taq酶（上海生工），20ng模板DNA，2％去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49．9～63．6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR—PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。

正交设计优化星星草ISSR-PCR反应体系研究

采用正交设计法优化适合于星星草的ISSR体系,对影响ISSR—PCR的多个因素,包括引物浓度、Taq酶的用量、Mg2+和dNTP浓度进行了比较、优化;同时又对DNA模板浓度,PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选。结果确定了星星草ISSR—PCR反应体系的最佳方案为:PCR扩增程序,94℃预变性5min;进行40个循环的94℃变性45s,55℃复性45 s,72℃延伸2 min;72℃延伸10 min,4℃保存。20μl反应体系包括10%buffer 2μl、模板DNA60ng、dNTP 100μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、引物0.8mmol/L、Mg2+2.0mmol/L。