泽泻ISSR反应体系的建立与优化

以四川泽泻为实验试材，采用改进的CTAB法提取了泽泻的高质量总DNA模板，克服了泽泻中所富含的酚类物质的影响．对泽泻ISSR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选，建立了标记位点清晰、稳定、重复性好、可用于泽泻ISSR-PCR分析的最适反应体系，它们是：25μLPCR反应体系中，10×Taq酶配套缓冲液，IUTaqDNA聚合酶，1．8～2．0mmol／L MgCl2，100μmol／LdNTP，0．3μmol／L引物，DNA模板约10-20ng，退火温度在52-60％；

大果油茶基因组DNA提取及ISSR反应体系建立(英文)

【目的】建立大果油茶的ISSR-PCR适宜扩增反应体系和程序,为其深入研究奠定基础。【方法】以大果油茶嫩叶片为供试材料,采用改良的SDS法提取其基因组DNA,并对其ISSR反应体系条件进行筛选及优化。【结果】提取的基因组DNA纯度和完整性较好,OD260/OD280值在1.8～2.0之间,DNA无降解现象,完全可以满足ISSR-PCR扩增要求。在25.0μLISSR-PCR反应体系中,各组分的适宜浓度配比为:40ng/μL模板DNA1.0μL、2.5mmol/LdNTPs2.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL、10μmol/L引物1.0μL、10×PCR Buffer2.5μL(含有Mg2+),加ddH2O至25.0μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性40s,52℃和53℃退火40s,72℃延伸90s,40个循环;最后72℃延伸7min。由此可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱。【结论】建立的ISSR-PCR反应体系可用于研究大果油茶遗传变异和多样性。

耐旱苔藓植物DNA提取及优化RAPD、ISSR反应体系的建立

耐旱苔藓植物常常单个个体矮小、生物量低,如何从细小的单个个体中有效提取总DNA是进一步开展居群遗传多样性研究的关键。本研究以古尔班通古特沙漠广泛分布的刺叶墙藓(Tortula desertorum)为对象,使用快速提取法、2×CTAB法及DNeasy plant mini kit试剂盒提取法等3种方法对刺叶墙藓单个个体的总DNA进行提取。结果表明,2×CTAB法提取的DNA纯度高,凝胶电泳显示无明显降解现象,适宜作为PCR扩增的模板。利用所提取的单个个体DNA为模板,建立了优化的RAPDI、SSR反应体系。

适合于苹果的ISSR反应体系的建立

以富士苹果为试材 ,对ISSR反应体系中的诸如模板DNA、Mg2 + 、dNTP和TaqDNA聚合酶的浓度进行了探索 ,确立了适合富士苹果的ISSR反应体系 :在 2 5 μl反应体系中 ,含 1×缓冲液 [10 0mmol·L-1KCl、80mmol·L-1(NH4) 2 SO4、10 0mmol·L-1Tris HCl,pH 9.0 ,NP 4 0 ]、1.5mmol·L-1MgCl2 、0 .2 0mmol·L-1dNTP、0 .4 0 μmol·L-1引物、2 0ngDNA。

烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)ISSR反应体系的优化及遗传多样性分析

以烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)基因组DNA为模板,采用单因素和正交设计L_(16)(4~5)相结合的方法对影响ISSR-PCR反应的主要因子进行优化,并对采自东北三省烟区的20个烟草靶斑病菌菌株进行ISSR分析,建立了适宜于病菌的ISSR分子标记的最佳反应体系,即20μL的反应体系中含有模板DNA 30ng,Mg^(2+)浓度2.0mmol·L^(-1),d NTP浓度0.20 mmol·L^(-1),Taq酶1.0U,引物浓度0.4μmol·L^(-1)。利用优化的反应体系从20个ISSR引物中筛选出13个多态性和重复性好的引物,对20个烟草靶斑病菌菌株进行ISSR分析,共扩增出132条带,多态条带比率为73.48%,在相似系数0.74处将其划分为3个类群,其中LTL-7、HLK-1、HBX-2、HBX-4、LFC-9、LTL-5、LTL-9和JLH-1共8个菌株被划分在IGⅠ中;IGⅡ中包括LTL-6、LKD-8、HLK-3、LTL-115、LTL-2、LFC-4和LTL-8共7个菌株;其余5个菌株分别为LTL-66、LTL-111、HLK-4、JLH-3和LTL-22被划分到IGⅢ中。分析结果表明ISSR遗传聚类组群与菌株的地理来源具有一定的相关性,而与菌株的致病性无明显的相关性。

甘薯DNA提取及ISSR反应体系的建立

以甘薯幼叶为试验材料,对甘薯基因组DNA的提取,并对其纯度、浓度进行检测,结果表明,DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要。同时对甘薯ISSR-PCR反应体系中各个影响因素进行了优化,建立了适合甘薯ISSR分子标记的最佳反应体系,即在20μl的反应体系中,含稀释浓度为10倍的DNA模板,0.30 mmol/L dNTP,1.00μmol/L引物,1.00 UTaq酶,0.5%去离子甲酰胺比较适合甘薯DNA的特异扩增。

菊属ISSR反应体系的建立及优化

以菊属野生种和不同类型菊花品种为试验材料,通过正交试验对菊属ISSR-PCR反应体系进行初选,在此基础上对体系中的dNTP、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶、模板DNA等最佳浓度进行了筛选,通过稳定性检测,优化了菊花ISSR-PCR反应体系:总体积20μl,DNA模板量60 ng;引物浓度0.5μmol/L;dNTP浓度100μmol/L;Mg2+浓度1.875 mmol/L;Taq聚合酶1 U。

亮叶蜡梅ISSR反应体系的建立与优化

为了建立和优化亮叶蜡梅（Chi monanthus nitens Oliv.）的ISSR反应体系,对模板DNA的浓度、引物浓度、Mg2＋浓度等影响因子进行了筛选。结果表明：在25μL的反应体系中,含有40 ng模板DNA、1 UTaq酶、0.2 mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2＋、2.5μL 10×buffer的扩增效果最好。利用该优化的反应体系,筛选出了12条稳定性强、清晰度高、多态性高的ISSR引物,并对筛选出的12条引物在不同退火温度（51-56℃）下的扩增效果进行了比较,从而确定了每个引物的最佳退火温度。

九眼独活基因组DNA提取、ISSR反应体系优化及引物筛选

目的探讨九眼独活基因组DNA提取方法、ISSR反应体系优化及引物筛选,为研究九眼独活居群遗传多样性及原药材DNA鉴定奠定基础。方法采用改良的CTAB法与常规CTAB法对九眼独活的基因组进行提取,通过紫外、电泳、PCR-ISSR检测方法进行比较。结果实验表明,改良的CTAB法得到的DNA浓度和纯度较高,并可很好地应用于ISSR分子标记分析;以Mg2+、dNTP、引物和聚合酶建立L9(34)正交设计,并同时考察退火温度和模板浓度,建立适宜的25μLISSR-PCR体系为:模板30ng,Mg2+3.5mmol.L-1,dNTP0.6mmol.L-1,引物0.4μmol.L-1,Taq酶1U。结论以此体系为基础进行引物筛选,在40条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。

芒果ISSR反应体系的建立与优化

运用L16（4^5）正交设计对芒果ISSR反应的5个因素，即DNA模板浓度、M矿浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化试验，通过不同反应体系扩增效果比较，建立优化的芒果ISSR反应体系，

茉莉花ISSR-PCR反应体系的建立

以茉莉花为材料，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对茉莉花ISSR扩增结果的影响。结果表明：在20μL的反应体中，Mg^2＋的用量为1．2～1．6mmol／L，dNTPs浓度为0．15mmol／L，引物的浓度为0．5μmol／L，TaqDNA聚合酶的用量为1U，模板DNA的用量为40-70ng，在48-50℃的退火温度下40个循环，能得到清晰、多态性高的ISSR带谱。

花椰菜的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以花椰菜基因组为材料,通过单因素试验,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度,DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量,引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合花椰菜的ISSR-PCR反应体系:25μL反应体积:内含10×PCR反应缓冲液(含Mg^(2+))2.5μL、0.5U TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTPs、0.5μmol/L引物、60ng模板DNA。确定了适宜的退火温度为48.6℃。扩增程序为94℃预变性5 min;然后94℃变性30s,46.9℃退火45 s,65℃延伸1.5min,35个循环;最后65℃延伸7min,4℃保存。用120条引物对花椰菜基因组进行标记,筛选出引物TI-13可以将这6份花椰菜材料区分开。花椰菜ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行花椰菜品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础。

金钗石斛遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的:对影响金钗石斛ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法:通过筛选引物并设定影响金钗石斛ISSR反应诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立金钗石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果:金钗石斛较适宜的ISSR-PCR反应条件为:10 lμPCR反应体系,含5～15 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTP、0.6～0.75 U Taq DNA聚合酶、1.0μmol/L引物。较适宜的退火温度为46～62℃。结论:Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的金钗石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究。

砂梨的ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以中国南方主要栽培果树砂梨基因组为材料,采用改进的CTAB法提取叶片基因组DNA,通过单因素试脸,对ISSR-PCR反应体系中各种影响因子如dNTPs浓度、DNA模板含量,Taq DNA聚合酶量、引物用量以及最适退火温度等进行了优化和筛选,建立了适合砂梨的ISSR-PCR反应体系和应用程序为为:20μLPCR体系中,1xTaq酶配套缓冲液,0.5UTaq DNA聚合酶,0.7μmol/L引物,100μmol/L dNTPs,2.25mmol/L MgCl2,40ng模板DNA。最佳扩增程序为:预变性:94℃5min;94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸1min;共40个循环后,最后72℃延伸10min,4℃保存。用引物836可以将这16份砂梨材料区分开。砂梨ISSR反应体系的建立为利用分子标记技术进行砂梨品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析莫定了良好基础。

珠子参ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的：建立珠子参的ISSR-PCR适宜扩增反应体系和程序，为其深入研究奠定基础。方法采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取珠子参总DNA ，并用正交设计实验对其ISSR反应体系条件进行筛选及优化。结果提取的基因组DNA纯度和完整性较好，A260/A280值在1．8～2．0之间，DNA无降解现象，可满足ISSR-PCR扩增要求。珠子参ISSR分析的最适反应体系为：在20μL PCR反应体积中，含10 ng模板DNA、0．20 mmol·L -1 dNTPs、1．5μmol·L -1引物、3U TaqDNA 聚合酶、2μL 10× PCR Buffer、3 mmol·L -1 Mg2＋。扩增程序为：95℃预变性5 min ，94℃变性30s，58℃退火30 min ，72℃延伸1 min ，循环40次，72℃延伸10 min。由此可获得带型丰富和清晰可辨的DNA指纹图谱。结论建立的ISSR-PCR反应体系可用于研究珠子参的遗传变异和遗传多样性。

荸荠ISSR反应体系的优化和应用

荸荠（Eleocharis dulcis）属于莎草科多年生水生草本植物,以其地下球茎作为食用器官,荸荠营养丰富,口感甜脆,不仅可以果蔬两用,而且可以入药,具有清热止渴、利尿化痰、降血压等功效。

白芷ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的：建立白芷的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数，为今后利用ISSR标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：以白芷基因组DNA为模板，分析了ISSR反应体系中模板DNA、Mg^2＋、dNTPs、引物浓度，TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好，分辨率高的ISSR反应体系，即在25μL反应体系中，模板DNA浓度为10～30ng，2．5μL 10×PCR buffer（Mg^2＋ free），MgCl2 2．0mmol／L，dMTPs0．2mmol／L，Taq酶1．0U，引物0．6μmol／L；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物在筛选后的最佳退火温度退火45s，72℃延伸2min，共计39个循环，循环结束后在72℃延伸5min。结论：建立了适用于白芷的ISSR反应体系，为今后利用ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础。

贵州石笔木DNA提取与ISSR-PCR反应体系的建立

[目的]利用ISSR技术对贵州石笔木的遗传多样性进行分析。[方法]以贵州石笔木种子、新鲜叶片和干燥叶片为试材,采用改良的CTAB法和SDS法提取贵州石笔木基因组DNA,并对提取DNA的浓度和纯度进行测定。通过单因子梯度试验,筛选出优化、稳定的ISSR-PCR反应体系。[结果]利用CTAB法和SDS法从石笔木叶片中提取DNA时,鲜叶和干燥叶片提取的DNA质量和浓度略有差别,CTAB法提取的浓度稍大而蛋白残留稍多,SDS法提取的DNA量稍少但质量最高。而从种子中提取的DNA无论质量还是浓度均较差,但尚可满足ISSR分子标记试验。贵州石笔木的适宜ISSR-PCR反应体系为2μl的10×Buffer,模板DNA 40 ng,dNTP 0.25 mmol/L,Taq酶1 U,引物0.2μmol/L,总体积为20μl。[结论]该ISSR技术体系适用于贵州石笔木遗传多样性分析。

乌腺金丝桃ISSR反应体系的构建及其遗传多样性分析

以14份乌腺金丝桃为试材,采用L_(16)(4~5)正交实验设计,建立并优化乌腺金丝桃的ISSR-PCR反应体系,并利用优化的反应体系分析供试材料间的遗传多样性。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中应含有Taq DNA聚合酶1.0U,dNTPs 0.2mmol·L^(-1),Mg^(2+)2.0mmol·L^(-1),模板DNA 45ng。从45条ISSR引物中筛选出11条多态性引物,利用筛选的多态引物对14份乌腺金丝桃材料进行了ISSR遗传多样性分析,共扩增出85条带,其中多态性条带57条,占67.06%;4个乌腺金丝桃居群的遗传相似系数介于0.375 1~0.725 2,平均值为0.541 6;通过UPGMA进行聚类分析表明,14份材料可分为3个类群4个亚群。乌腺金丝桃居群间遗传多样性水平明显高于居群内,其遗传距离与地理距离具有一定的相关性。

黄花蒿ISSR-PCR反应体系的优化

目的：建立黄花蒿（Artemisia annua L．）的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数，为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：以黄花蒿DNA为材料，分析了ISSR反应体系中的DNA、Mg^2＋、dNTPs浓度，TaqDNA聚合酶用量以及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好，分辨率高的ISSR反应体系，即在25止反应体系中，模板DNA浓度为15—45ng,2．5μL的10倍Buffer（Mg^2＋ free）缓冲液，MgCl2 2．0mmol／L，dNTPs为0．15mmol／L，Taq酶1．0U，引物1．0μmol／L；扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物在筛选后的最佳退火温度退火45s，72℃延伸2min，共计40个循环，循环结束后在72℃延伸5min。结论：建立了适用于黄花蒿的ISSR反应体系，为今后利用ISSR标记技术开展黄花蒿种间遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础。