基于ITGB4/FAK/p38信号通路蒙药蓝盆花总黄酮提取物体内外抗肝纤维化的作用研究

目的探讨蒙药蓝盆花总黄酮提取物(total flavonoid extract of Scabiosa comosa,TFS)对肝纤维化体内外的影响,以及通过对ITGB4/FAK/p38信号通路的调控对肝纤维化的作用。方法体内实验:选取50只Wistar大鼠随机分为空白组,模型组,TFS高(200mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)剂量组,除对照组外均给予2ml/kg CCl_(4)灌胃。期间对TFS各剂量组给药,而对照组和模型组不做处理,灌胃10周。检测血清丙氨酸氨基转移酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(glutamic-oxaloacetic transaminase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量及肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色、Masson染色观察肝组织病理学改变;肝组织经转录组测序筛选与肝纤维化相关的通路;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)与Western blot法分别检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、collagenⅠ及ITGB4/FAK/p38信号通路相关mRNA及蛋白表达情况。体外实验:MTT法检测TFS对HSC-T6细胞的抑制率;RT-qPCR与Western blot法分别检测HSC-T6细胞中α-SMA、collagenⅠ及ITGB4/FAK/p38信号通路相关mRNA及蛋白表达;流式细胞术检测不同浓度TFS对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果与空白组比较,TFS显著增加了模型组中ALT、AST、ALP及HYP的含量(P<0.01);与模型组比较,TFS显著降低了TFS剂量组中ALT、AST、ALP、HYP的含量(P<0.01);肝组织病理变化显示,肝纤维化增生明显改善;GO、KEGG富集分析表明,ITGB4/FAK/p38信号通路在模型组相关性显著。不同剂量的TFS对HSC-T6细胞均有抑制作用;体内外RT-qPCR与Western blot法检测结果显示,TFS各剂量组α-SMA、collagenⅠ、ITGB4/FAK/p38信号通路相关的mRNA及蛋白表达显著下降(P<0.05);凋亡结果亦显示,TFS各剂量组细胞凋亡数明显增加(P<0.01)。结论蒙药蓝盆花总黄酮提取物可显著抑制肝纤维化进展,其调控机制可能与ITGB4/FAK/p38信号通路有关。

荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用

目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R)。结果重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3nm。结论成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用。

整合素β4调控脑血管发育

【目的】探讨整合素β4(ITGB 4)对脑血管生长发育的调控作用。【方法】通过逆转录PCR(RT-PCR)检测靶向itgb 4 mRNA序列的吗啉环(MO)在斑马鱼胚胎中的敲低效果。利用体视显微镜和激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察抑制itgb 4表达后,斑马鱼胚胎脑部血管的发育变化。通过在斑马鱼胚胎中注射4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染料检测血脑屏障(BBB)发育的完整性。使用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D 3)中敲低ITGB 4,用蛋白免疫印迹(WB)检测其敲低效果。通过活细胞成像分析仪(IncuCyte®)、基质胶(Matrigel®matrix)成管实验和transwell迁移实验分别检测ITGB 4在hCMEC/D 3中调控细胞增殖、成管和迁移的作用。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测敲低itgb 4后Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因表达变化。【结果】在斑马鱼胚胎中敲降itgb 4引起脑水肿、脑部出血、血脑屏障形成障碍以及后脑血管数量减少等相关表型。细胞实验结果显示,在hCMEC/D 3细胞中抑制ITGB 4的表达导致细胞增殖减缓,管腔形成减少及迁移能力减弱。此外,qRT-PCR结果表明,在斑马鱼胚胎中敲低itgb 4抑制Wnt/β-catenin通路下游靶基因的表达。最后,在hCMEC/D 3细胞中敲低ITGB 4后,通过添加Wnt/β-catenin通路激活剂(BML-284)能明显挽回迁移减少的表型。【结论】ITGB 4通过调节脑血管内皮细胞的增殖、迁移和成管等功能促进脑血管发育并参与调控血脑屏障的形成。

一个致死性大疱性表皮松解症伴幽门闭锁家系的遗传学分析与产前诊断

大疱性表皮松解症(epidermolysis bullosa,EB)是一种罕见的具有临床和遗传异质性的遗传性皮肤病,以皮肤、黏膜脆性和水疱形成为特征,常由微创诱发,在欧洲EB患儿的出生率为1.9/100000[1]。EB主要分为4种类型:单纯型(EBS)、交界型(JEB)、营养不良型(DEB)和Kindler综合征(KS)。EB的临床表型具有差异性,可从轻度皮肤脆性到严重皮肤受累。目前已报道与EB发病相关的致病基因至少有20种,这些基因编码的蛋白质主要影响细胞的完整性和黏附性[2-4]。作为JEB的亚型,EB伴幽门闭锁(EB with pyloric atresia,EB-PA)是指皮肤脆性伴有先天性胃肠道闭锁的综合征,包括幽门闭锁、十二指肠闭锁和食管闭锁。

P311和整合素β4结合蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 探讨P311和整合素β4结合蛋白（ITGB4BP）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义.方法 80例NSCLC石蜡标本制成组织芯片,采用链菌素亲生物素-过氧化物酶法（SP）检测F311和ITGB4BP的表达情况,应用SPSS 13.0软件进行统计分析.结果 P311和ITGB4BP在NSCLC中的阳性表达率分别为77.5%（62/80）和82.5%（66/80）,P311和ITGIMBP表达均阳性者占73.8%（59/80）,一致率为87.5%,具有显著一致性（Kappa=0.611,P〈0.001）.结论 NSCLC中可能存在一条新信号途径P311-ITGB4BP,且可能具有调节肺癌细胞迁移的作用.