兜兰ITS-PCR反应体系的建立及优化

为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系。结果表明:最佳反应体系为25μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+1.5mmol/L、dNTP 0.15mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40ng,反应程序为94℃预变性4min,1个循环;94℃变性30s,54℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸7min后终止反应,4℃保存。利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段。

土壤微生物总DNA的提取以及土壤真菌ITS-PCR体系的建立

18S rDNA及28S rDNA间的rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列已广泛运用到多种真菌种属水平的分类鉴定研究中,利用Tiangen DP330土壤提取试剂盒对土壤总DNA进行提取并对真菌的ITS-PCR体系进行优化。研究发现:样品在-20℃低温下短期保存对DNA的提取质量无明显影响。对土壤真菌ITS-PCR扩增条件中的各个因素进行了优化,建立了引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为0.2mmol/L、Taq酶的用量2.5U、DNA模板用量为30ng^90ng的最佳ITS-PCR扩增体系。

红山茶总DNA提取及ITS-PCR扩增条件优化研究

利用CTAB法对红山茶组植物总DNA进行提取研究,发现用嫩叶可获得纯度较高的DNA,样品在-20℃低温下短期保存对DNA的提取质量无明显影响,同时,对红山茶PCR扩增条件中的各个因素也进行了多梯度的优化研究,建立了引物浓度0.5μmol/L、Mg2+浓度为2.0～2.5mmol/L、dNTP浓度为0.2mmol/L、Taq酶的用量为1.2U、DNA模板用量为50～60ng的最佳ITS-PCR扩增条件。

珍珠黄杨ITS-PCR体系的建立与优化

本研究利用改良CTAB法从珍珠黄杨叶片中提取基因组DNA作为模板,在TaqDNA聚合酶量不变的基础上,利用正交设计L9(34)对4个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP和引物)在3个水平上对珍珠黄杨ITS-PCR反应体系进行优化。实验结果表明,在总体积50μL的反应体系中,建立了最佳ITS-PCR扩增条件:Mg2+浓度2.0mmol/L、引物浓度0.3μmol/L、dNTP浓度0.3mmol/L、DNA模板浓度240ng/50μL、TaqDNA聚合酶的用量1.75U/50μL和退火温度56℃,该优化体系保证了珍珠黄杨ITS-PCR产物的纯度和质量要求。珍珠黄杨ITS片段克隆测序后获得的序列长度为642bp,其系统学信息将为珍珠黄杨的起源进化提供有力的分子水平证据。

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。

赤松外生菌根ITS-PCR体系的建立及优化

以CTAB法提取的赤松外生菌根DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验,系统的分析了DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了赤松外生菌根rDNA ITS扩增反应的优化体系,最优反应体系为:20μL体系中,1×PCR buffer 2μL、DNA模板30 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.5 U。

浙贝母ITS-PCR体系优化与不同产地样品序列差异研究

目的:优化浙贝母的ITS-PCR扩增体系,并对不同来源浙贝母品种的ITS序列进行差异分析。方法:浙贝母样品采用减压干燥法处理,以广谱植物基因组总DNA提取试剂盒提取浙贝母总DNA,对反应过程中的退火温度、Taq酶浓度、Mg2+、dNTP浓度等因素进行考察。采用Conting Express和DNAman等分子生物学软件进行序列处理。结果:最优的浙贝母ITS-PCR扩增体系为:50μL反应体系中含Taq酶1 U,2.5 mmol/L Mg2+、dNTP分别为4μL,退火温度为56℃。浙贝母的ITS序列全长668 bp,G+C含量为65.4%,不同产地浙贝母的ITS序列无差异。结论:所建立的体系可用以浙贝母ITS序列分析,为浙贝母的ITS序列研究奠定基础。ITS序列不适合作为浙贝母种间和产地间的鉴别工具。

南海芋螺ITS-PCR体系的建立与优化

为了建立适合南海芋螺的ITS-PCR体系以研究不同种类芋螺的遗传多样性,以多种芋螺的3种不同组织为材料,利用海洋生物基因组试剂盒法提取芋螺基因组DNA为模板,采用正交试验对ITS-PCR过程中的关键影响因素进行优化,以最优ITS-PCR体系扩增获得不同种类芋螺的ITS序列并进行测序鉴定。结果表明:最佳ITS-PCR反应体系(25μL)为Taq酶0.3U,dNTPs 3mmol/L,Mg^(2+)1.0mmol/L,引物2.0μmol/L,模板40ng,10×PCR Buffer(不含Mg^(2+))2.5μL,ddH_2O补足25μL。采用该最佳体系对芋螺基因组DNA进行PCR扩增,产物经单向测序获得芋螺ITS部分序列,经NCBI数据库比对其匹配度为83%。

南药益智ITS-PCR体系的建立与优化

为了建立适合南药益智的ITS-PCR体系来研究不同地理居群益智遗传多样性,本研究利用植物基因组试剂盒法提取益智基因组DNA为模板,采用单因素和正交试验对ITS-PCR过程中的关键影响因素进行优化,并对ITS-PCR产物进行测序鉴定。实验结果表明最佳ITS-PCR反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,d NTPs 4 mmol/L,Mg2+0.5 mmol/L,引物2.0μmol/L,模板20 ng,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5μL;最佳扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共32个循环;最后72℃延伸5 min。采用该最佳体系对益智基因组DNA进行PCR扩增,获得扩增产物经单向测序获得了益智ITS部分序列。建立了稳定的ITS-PCR体系,为研究益智遗传多样性分析奠定了基础。

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。

一种适于PCR反应的快速提取食用菌基因组DNA的方法

目的:建立一种以食用菌菌丝体和子实体为原材料的快速提取其基因组DNA的方法,从而提高基因组DNA的提取效率,为食用菌分子生物学提供便利。方法:分别以平菇黑平王的菌丝体和子实体为材料,快速提取其基因组DNA,并以此为模板进行ITS序列扩增。结果:采用方法提取的基因组DNA结构完整,无明显拖尾现象,浓度大约为10ng/μl,以此为模板能够获得预期的ITS条带。结论:该方法具有简便、快速、经济、无污染等优点,提取的基因组DNA适用于PCR反应等分子生物学研究,提高了提取效率,可作为高通量的提取方法。

一株甘蔗黑穗病菌的分离与系统发育分析

甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的一种世界性病害,严重危害甘蔗的生产,对该病病原菌的研究有助于甘蔗抗黑穗病育种。由于rDNA序列兼具保守区域和进化水平不同所致可变区,因此,rDNA序列分析是研究真菌系统发育、分类鉴定和分子检测非常有效的手段。笔者采用单孢分离方法,从高抗品种NCo376的病株上分离单孢,培养菌丝体,提取基因组DNA,分析其rD-NA序列,以期丰富该真菌的遗传多样性研究。用真菌rDNA序列分析的通用引物ITS1和ITS4,通过ITS-PCR得到目的片段,克隆在pMD18-T载体上后进行测序,结果显示该片段的长度为692bp,与Genebank中已报道的真菌序列进行Blast和系统发育树分析,表明所获得的序列与Sporisorium属真菌具有更高的亲缘关系,而与Ustilago属真菌的亲缘关系较远,这与一直沿用的甘蔗黑穗病菌的命名似乎并不吻合,有待进行更多的研究以证实。

海南蔗区甘蔗黑穗病菌的分离鉴定

甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的一种真菌病害,严重危害甘蔗生产。为了能够准确鉴定海南黑穗病菌和选育出抗黑穗病的甘蔗品种,对采自海南省8个市(县)24个蔗区的24份甘蔗黑穗鞭进行病原菌分离,根据菌落形态学特征,结合光学显微镜观察及分子生物学方法进行鉴定,确定所分离到的病原菌即是甘蔗黑穗病菌(Ustilago scitaminea Syd.)。结果将为甘蔗黑穗病菌生理小种的鉴定奠定基础。

香蕉细菌性软腐病菌致病性分化和遗传多样性分析

目的:研究广东香蕉细菌性软腐病菌Dickeyaparadisiaca的致病性差异和遗传多样性.方法:采用香蕉假茎离体接种法和幼苗盆栽接种法对分离自广东香蕉的13个菌株进行致病性分析;利用16S-23SrDNA转录间隔区PCR(ITS-PCR)和细菌基因组的重复序列PCR(Rep-PCR)技术,对供试菌株的遗传多样性进行研究.结果:采用2种不同的接种方法,供试菌株致病力均可划分为强(++++)、较强(+++)和中等(++)3种致病型,2种方法得到的结果基本一致,且与菌株的地理来源有一定的相关性;利用ITS-PCR扩增,可将供试菌株划分为6个组群;而利用细菌基因组重复序列通用引物BOX和J3进行Rep-PCR扩增,在遗传距离为0.52时,供试菌株可被划分为2个遗传相似组,其中组1为主要组群;在遗传距离为0.65时,供试菌株可被划分为4个遗传相似组,其中组3和组4为主要组群.结论:侵染广东香蕉的细菌性软腐病菌存在明显的致病性分化和丰富的遗传多样性.

T-RFLP分析不同森林类型土壤真菌组成及分布

在长白山森林生态系统定位站,利用T-RFLP技术研究了6种不同森林类型土壤真菌组成及其分布特征。结果表明,6种不同森林类型土壤真菌多样性指数以白桦林中后期最高,过熟阔叶红松林次之,杨桦成熟林最低。不同森林类型的真菌群落相似度也很低,其数量、类型及分布均存在着差异。

巨菌草对鄂尔多斯砒砂岩土壤酶活性和可培养真菌的影响

采用比色法、磷酸苯二钠法以及滴定法测定了鄂尔多斯砒砂岩地区3块样地(农田、山顶、河滩)种植巨菌草后的5种土壤酶活性变化,运用稀释平板法与ITS-PCR相结合的方法研究了其土壤真菌多样性.结果表明,种植巨菌草后,土壤脲酶活性显著升高,农田、山顶和河滩最高脲酶活性分别为种植前的9.83、4.39和9.45倍;多酚氧化酶活性显著降低,与种植前相比,农田、山顶和河滩最大降幅分别达67.11%、66.11%和73.49%;蔗糖酶活性变化不一,与种植前相比,山顶最大降幅达73.66%,而农田最高酶活性增加了16.80倍,河滩无明显变化;山顶、农田和河滩的碱性磷酸酶活性最高分别为种植前的1.22、3.11和1.50倍;过氧化氢酶活性变化稍复杂,在巨菌草生长期内出现最低值和最高值,农田、山顶和河滩酶活性最低分别比种植前降低了23.29%、50.04%和74.79%.3块样地的土壤真菌数量均在巨菌草分蘖期达到峰值,河滩、农田、山顶分别鉴定出21、15、30株优势菌株,被孢霉属、青霉属在种类和数量上所占比例较大.相关性分析显示,碱性磷酸酶与脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶呈极显著正相关关系,过氧化氢酶与脲酶、蔗糖酶呈极显著正相关关系,其他土壤酶之间相关性不显著;可培养真菌与蔗糖酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶呈正相关关系,与脲酶呈负相关关系,但相关性均不显著.

First report on molecular characterization of Leishmania species from cutaneous leishmaniasis patients in southern Khyber Pakhtunkhwa province of Pakistan

Objective: To report presence of Leishmania major in Khyber Pakhtunkhwa of Pakistan, where cutaneous leishmaniasis(CL) is endemic and was thought to be caused by Leishmania tropica only. Methods: Biopsy samples from 432 CL suspected patients were collected from 3 southern districts of Khyber Pakhtunkhwa during years 2011–2016. Microscopy on Giemsa stained slides were done followed by amplification of the ribosomal internal transcribed spacer 1 gene. Results: Leishmania amastigotes were detected by microscopy in 308 of 432 samples(71.3%) while 374 out of 432 samples(86.6%) were positive by ribosomal internal transcribed spacer 1 PCR. Subsequent restriction fragment length polymorphism confirmed Leishmania tropica in 351 and Leishmania major in 6 biopsy samples. Conclusions: This study is the first molecular characterization of Leishmania species in southern Khyber Pakhtunkhwa. It confirmed the previous assumptions that anthroponotic CL is the major CL form present in Khyber Pakhtunkhwa province. Furthermore, this is the first report of Leishmania major from a classical anthroponotic CL endemic focus identified in rural areas of Kohat district in southern Khyber Pakhtunkhwa.

基于ITS序列研究南药益智遗传多样性

海南岛益智及其姜科资源丰富,本研究基于ITS序列分析技术来研究海南岛不同居群益智及其姜科资源的遗传多样性。在海南岛内采集23份样品,其中益智样品18份,其他姜科植物样品5份,并从GenBank中获取3份山姜属植物的ITS序列作为研究系统的外群。通过软件Mega5.1比较分析了益智及其姜科植物的遗传距离和ITS序列的变异位点和信息位点,构建了NJ系统树等分析了益智种内与其姜科植物种群间的遗传多样性。研究结果表明海南岛不同居群的益智种内ITS序列无差异,未发现遗传变异位点,而姜科植物种间差异显著,表明其遗传多样性丰富。本研究为南药益智的种质资源的保护和可持续利用奠定理论基础。

一株高产木质纤维素酶红侧耳菌株的筛选及鉴定

高产木质纤维素酶菌株的筛选及鉴定对玉米秸秆生物质资源的综合利用具有重要意义。以前期采用原生质体诱变技术获得的3株红侧耳菌株CM12、CM13和CM16为试验材料,通过拮抗试验、生长速度测定试验进行优势突变菌株的初筛,漆酶、锰过氧化物酶、木聚糖酶、纤维素酶活力的测定进行高产木质纤维素酶突变菌株最终筛选,并对其进行ITS-PCR鉴定。结果表明:3株菌株与原菌株均产生明显拮抗;CM13菌株在PDA固体培养基中的生长速度最快,高于CM12、CM16及原菌株;CM13菌株在纯玉米秸秆粉培养基中漆酶、锰过氧化物酶、木聚糖酶和纤维素酶活力均最高,分别为121.23,144.11,793.38,238.92 U/L,比原菌株酶活力分别提高了13.07%、12.90%、19.93%和30.22%。ITS-PCR结果表明,CM13菌株在分子水平上发生了变异。