基于APG IV系统的植物分类学教学方法研究与实践

APG系统以DNA分子为依据的最新被子植物分类系统,与传统形态分类系统有较大的差异,文章较为详细地比较了系统间“目科属”分类系统的不同。作者将APG系统应用于植物学理论教学、实践教学中,构建全新的教学体系;利用网络资源,充分学习APG系统,取得一定的教学效果。从教学方法、教学体系的更新、教材建设、兴趣小组建立等方面对未来植物学教学提出新的思考。

细菌IV型分泌系统结构的研究进展

革兰氏阴性菌的IV型分泌系统(T4SS)是一个由ATP供能,多种蛋白质复合构成的体系,该体系能够跨过整个细胞外膜、分泌大量底物。详细阐述了T4SS组成元件的结构,如底物转运通道、核心复合物、外膜复合物、内膜复合物、菌毛等。T4SS更大组成元件、其他结构、组成元件间相互作用的机理等有待进一步研究。

新型TiGRT IVS系统引导肺癌调强放射治疗摆位研究

目的:以锥形束CT(cone beam CT,CBCT)配准结果为参考,验证TiGRT IVS系统的在线校位精度,从而验证其临床有效性及可行性。方法:选择2019年10月至2020年2月在陆军军医大学第二附属医院全军肿瘤研究所放疗中心接受调强放射治疗的30例肺癌患者。首次摆位时行TiGRT IVS系统和CBCT位置验证,常规剂量分割患者每周行1次位置验证,大剂量分割患者每次治疗时均行位置验证,并与数字重建放射影像(digitally reconstructured radiograph,DRR)图像进行配准。其中TiGRT IVS系统配准方法分为IVS-A和IVS-B 2种,IVS-A根据椎体、肋骨等进行骨性配准;IVS-B在IVS-A的基础上,正位片采用气管作为特征结构进行配准。将IVS-A和IVS-B配准的结果与CBCT进行比较,观察TiGRT IVS系统对肺癌调强放射治疗摆位误差的分析与控制结果。结果:IVS-A、IVS-B、CBCT配准所需时间分别为(69±12)、(54±8)、(112±14)s,TiGRT IVS系统配准时间少于CBCT,而且IVS-B配准时间少于IVS-A。TiGRT IVS系统的摆位误差主要集中在0~5 mm,8 mm以上的摆位误差很少,且TiGRT IVS系统与CBCT得到的摆位误差只有在患者Vrt(前后)方向上具有统计学差异,但在临床标准范围内。对于1例大剂量分割患者在Lng(头脚)方向前1~7治疗分次的摆位误差,TiGRT IVS系统配准结果与CBCT相比有统计学差异。结论:TiGRT IVS系统能够有效测出肺癌患者调强放射治疗的摆位误差,正位片中可选气管作为配准的特征结构,大剂量分割患者图像引导时可结合CBCT观察靶区位置。

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白VceC对山羊滋养层细胞内质网应激和性腺激素分泌的影响

旨在研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应分子VceC对山羊滋养层细胞(GTC)内质网应激及性腺激素分泌的影响,为揭示其在布鲁氏菌感染宿主细胞中的作用,阐明布鲁氏菌胞内生存和引起动物流产的机制提供重要依据。本研究通过构建VceC的真核表达载体pEGFP-C1-VceC并转染GTC,Western blot检测内质网应激标志性分子GRP78和CHOP蛋白表达量变化,qRT-PCR和Western blot进一步检测未折叠蛋白反应(UPR)信号通路相关分子;ELISA检测细胞培养上清液的孕酮和雌激素的浓度变化。结果表明,成功构建了VceC真核表达载体pEGFP-C1-VceC,转染GTC后,12和24 h GRP78蛋白表达均显著升高(P<0.01),24 h后CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05);qRT-PCR检测IRE1和XBP-1的mRNA表达量在24 h均显著升高(P<0.05),而PERK、ATF6和ATF4 mRNA的表达未发生显著变化(P>0.05),Western blot检测IRE1蛋白的表达在转染12 h后显著升高(P<0.01);VceC转染组细胞培养上清液中孕酮含量在转染12和24 h后显著低于空白组和空载体组(P<0.01),雌激素无显著差异(P>0.05)。证明布鲁氏菌VceC不仅能通过激活UPR中的IRE1通路从而激发GTC的内质网应激反应,还能改变GTC中孕酮/雌激素的比值。

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因的克隆及生物信息学特征预测

目的：构建表达幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，H.pylori）NCTC11637IV型分泌系统cagX（HP0528）全长编码基因的原核表达载体。方法：用PCR方法从H．pylori基因组DNA中扩增cagX编码基因片段，将cagX克隆至pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5ct，再将其定向插入pET32a（＋）载体中，经IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果，并进行序列测定和生物信息学预测。结果：克隆幽门螺杆菌NCTC11637cagX基因全长1569bp（基因库登录号为EF608160），编码522个氨基酸，融合蛋白的相对分子质量约为80．5kD。与基因库公布的其他H．pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为96％～99％。预测结果显示H．pylori 11637，26695，J99间二级结构有一定差异，但抗原性相同。结论：成功克隆并表达了H．pyloriNCTC 11637 cagX基因，并对其生物学特征进行了预测，为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

布鲁氏菌的Ⅳ型分泌系统

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患病,给养殖业、人类健康和动物源性食品安全带来很大威胁。布鲁氏菌的IV型分泌系统在布鲁氏菌的致病力上发挥重要作用,与布鲁氏菌在宿主细胞内生存、复制有密切关系。IV型分泌系统由virB操纵子编码,由同一启动子调控,是一个多蛋白的跨膜复合物,受感染宿主细胞类型、生长温度、营养条件、pH值等多因素调控;并且对布鲁氏菌的胞内、胞外的生存产生重要影响。

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定

目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)IV型分泌系统cagX基因缺失株,为研究cagX基因的功能奠定基础。方法:利用基因同源重组原理,设计cagX基因上下游同源臂片段,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后酶切鉴定,将纯化后的同源臂片段连接到含卡那霉素抗性基因的载体pBluescript SKⅡ(-),即cagX基因自杀质粒pBlueKM40-ΔcagX;自杀质粒电击转化HpNCTC 11637,通过卡那霉素筛选基因缺失株,后经PCR和DNA测序鉴定。结果:构建成功了幽门螺杆菌cagX基因自杀质粒,并转化至HpNCTC 11637内。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagX基因缺失株Hp11637-ΔcagX。

贝氏柯克斯体Ⅳ型分泌系统效应蛋白研究进展

贝氏柯克斯体是重要人兽共患病——Q热的病原,Dot/IcmⅣ型分泌系统(T4BSS)是其重要致病因素。贝氏柯克斯体T4BSS分泌的效应蛋白参与调控柯克斯体寄生泡发育成熟,以及宿主细胞的物质分泌运送、自噬与凋亡、转录与翻译、炎性反应等信号通路,为贝氏柯克斯体的宿主细胞内生长繁殖提供必要的场所和物质。

细菌的IV型分泌系统

细菌的分泌系统与细菌的生存及致病性密切相关。细菌的分泌系统包括I-VI型,其中,IV型分泌系统是与细菌接合机制有关的一类分泌系统。IV型分泌系统不但可以转运DNA,还可以转运蛋白质及核糖核蛋白复合物等大分子物质,这点区别于其他几种分泌系统。IV型分泌系统介导基因水平转移,通过细菌间接合作用,传递抗性基因和毒力基因,有利于细菌进化;另一方面,IV型分泌系统转运效应蛋白质分子到宿主细胞,参与细菌致病。本文着重从IV型分泌系统几种主要类型的分泌机制等方面对IV型分泌系统进行概述。

幽门螺杆菌细胞毒导致胃癌发生的作用机制

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染导致胃癌的重要原因之一是它的细胞毒作用。细胞毒素相关基因致病岛(cytotoxin-associated gene pathogenicity island,cagPAI)和空泡毒素A(vacuolatingcytotoxin A,vacA)是Hp最典型的细胞毒代表。cagPAI可诱发促炎因子的释放及增强促上皮细胞增殖信号的兴奋程度;vacA则导致上皮空泡化和病原体黏附。明确cagPAI和vacA在胃癌发生发展过程中的作用,将有利于全面理解Hp感染对机体造成的危害以及根治Hp感染的重要意义。

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System,T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni2+、H2O2、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。

人工诱变利福平抗性布鲁氏菌转录组测序分析

目的筛选布鲁氏菌中参与利福平代谢相关基因(除rpoB基因外)。方法利用人工诱变技术获得利福平抗性菌株,通过转录组测序获得标准菌株和利福平抗性菌株全基因组水平的基因表达量,利用EBSeq算法筛选差异表达基因,预测利福平代谢相关基因及主要代谢途径。结果通过不同浓度的利福平人工诱变,能够获得抗性表型稳定的布鲁氏菌变异菌株。转录组测序发现利福平抗性菌株中有121个基因表达量上调,197个基因表达量下调,差异基因功能主要集中于催化活性、细胞膜和细胞成分、代谢过程和细胞过程;主要参与抗生素的生物合成、细菌分泌系统和ABC转运蛋白等代谢通路。结论包括virB操纵子在内的涉及碳代谢等代谢通路的基因,通过表达量的改变参与抵抗利福平的作用。本研究为布鲁氏菌耐药相关基因的筛选提供新思路,同时为布鲁氏菌耐药菌株的防控提供基础性数据。

布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白的研究进展

布鲁菌是一种严重危害家畜和人类健康的人兽共患致病菌,近几年国内牛羊养殖场和人的感染率急速攀升,造成了一定程度的社会恐慌。研究认为,布鲁菌在细胞内可以利用Ⅳ型分泌系统（typeⅣsecretion system,T4SS）分泌多种效应蛋白进入宿主细胞,这些效应蛋白能够改变病原菌在感染细胞内的转运,避免最终被杀死;也能逃避感染细胞的免疫监视功能,维持其在细胞内的持续存在。本文将主要从Ⅳ型分泌系统的基本功能、效应蛋白筛选的方法、以及效应蛋白的功能研究作一简要总结,以期为后续研究提供一定的参考。

布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测

目的检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性，寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标。方法采用双酶切的方法，将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上，将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，异丙基-13-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达。利用重组VirB9蛋白所携带的His标签，通过Ni—NAT层析，纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白．再通过十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测。用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BALB／c小鼠，并以磷酸盐缓冲液（PBS）为对照。在免疫4周后，鼠尾取血，血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测$19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度。在免疫后第35天，取小鼠脾脏，分离脾细胞，利用Elispot技术，检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子（干扰素-1，IFN-1）的脾细胞数，酶联斑点图像仪计数斑点，每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞，分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况。结果通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741bp克隆至pET32a载体上。SDS—PAGE显示，VirB9蛋白的相对分子质量约43×103，纯度超过97％；BCA法检测，蛋白浓度为1．6异／L。免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度〉1：800；对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性。免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体，抗体滴度均〉1：3200，对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在。酶联斑点图像分析显示，用VirB9蛋白体外刺激，免疫组小鼠5×10s个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-r，对照组仅有38个细胞。结论在布鲁杆菌感染过程中，Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9具有免疫原性．能够刺激小鼠产生体液免疫反应与细胞免疫反应。

cagT——幽门螺杆菌cag致病岛的“底座”

毒素相关基因致病岛(cagPAI)是幽门螺杆菌的一个IV型分泌系统,由28～30个蛋白质组成。cagT是cagPAI的一个重要结构蛋白,位于cagPAI针尖状结构的基底部,作为此IV型分泌系统的"底座",与cagY蛋白一起构成了cagPAI的结构框架。将cagT基因敲除,则cagPAI结构消失,阻断了效应分子cagA进入宿主上皮细胞和IL-8的分泌。cagT还可与其他cagPAI蛋白质相互作用,协同转运cagA进入宿主细胞,引起宿主细胞的损伤。

异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性

【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a-cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素(或是抗菌药物)的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a-cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和WesternBolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白;经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2+-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性;通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即ΔA/(min.mg protein),结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。

细菌间bla_(NDM-1)传播规律的研究进展

新德里金属β-内酰胺酶-1 (New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1)导致革兰氏阴性细菌对几乎所有的β-内酰胺类抗生素(β-lactam antibiotic)产生抗性。携带NDM-1编码基因(bla_(NDM-1))的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和不动杆菌属(Acinetobacterspp.)细菌在世界各地广泛流行,严重威胁着公共健康。现对NDM-1的结构、突变亚型和传播规律进行综述,为预防和控制NDM-1携带菌提供策略。