IWR-1-endo对三阴性乳腺癌抑制作用的研究

目的探明新近发现的Wnt信号通路的小分子抑制剂IWR-1-endo是否会对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及该细胞系的裸鼠荷瘤模型的生长产生抑制作用及其机制。方法应用不同浓度的IWR-1-endo处理MDA-MB-231细胞并计算细胞增殖抑制率。建立裸鼠荷瘤模型并且每2天1次腹腔注射IWR-1-endo溶液0.1mL/10g,同时每4天1次测量瘤体长径和短径、计算肿瘤体积。4周后,处死小鼠、收集肿瘤组织、测量并计算体积抑瘤率和瘤重抑瘤率。将肿瘤组织制成石蜡切片,进行Ki-67染色及TUNEL染色,以计算增殖指数和凋亡指数。另应用western blot检测肿瘤细胞和组织中Axin 1、Axin 2、β-catenin和p-β-catenin蛋白的表达。结果 IWR-1-endo可以明显抑制MDA-MB-231细胞的生长,其抑制作用呈浓度依赖型,IC50值为180nmol/L。IWR-1-endo的体积抑瘤率为42.2%,瘤重抑瘤率为44.6%。与对照组比较,IWR-1-endo组凋亡指数上升,差异有统计学意义,而增殖指数差异无统计学意义。western blot检测结果显示细胞及组织中Axin 1和Axin 2表达量明显上升,β-catenin明显下降,而p-β-catenin上升。结论 IWR-1-endo可以通过稳定化Axin而抑制Wnt信号通路,实现对三阴性乳腺癌细胞系及裸鼠荷瘤模型生长的抑制。

IWR-1-endo通过抑制Wnt通路影响肝癌细胞的迁移和增殖

目的探讨Wnt通路抑制剂IWR-1-endo对人肝癌细胞Huh7生物学行为的影响及作用机制。方法体外培养人肝癌细胞Huh7,采用不同浓度(0、20、40、80、160、320μmol/L)IWR-1-endo作用于Huh7细胞。采用划痕实验检测不同药物浓度下细胞迁移能力的变化;平板克隆实验检测细胞的增殖变化;蛋白质印迹法检测Wnt通路相关蛋白β-catenin表达的改变;免疫荧光染色检测β-catenin在细胞质和细胞核的表达情况。结果划痕实验结果显示,0、20、40、80、160、320μmol/L浓度的IWR-1-endo处理Huh7细胞24 h划痕愈合率分别为(20.55±0.05)%、(12.10±0.08)%、(9.36±0.10)%、(3.62±0.09)%、(0.62±0.04)%、(0.23±0.02)%,差异有统计学意义(F=230.87,P<0.001);进一步两两比较,各浓度间24 h划痕愈合率差异均具有统计学意义(均P<0.001)。48 h划痕愈合率分别为(34.77±0.08)%、(17.69±0.05)%、(11.60±0.04)%、(5.68±0.07)%、(2.66±0.04)%、(1.75±0.02)%,差异有统计学意义(F=589.68,P<0.001);进一步两两比较,各浓度间48 h划痕愈合率差异均具有统计学意义(均P<0.001)。经0、20、40、80、160、320μmol/L浓度的IWR-1-endo处理肝癌Huh7细胞后,克隆形成率分别为(61.67±0.21)%、(57.33±0.11)%、(50.00±0.25)%、(36.67±0.28)%、(23.33±0.12)%、(15.00±0.08)%,差异有统计学意义(F=403.56,P<0.001);进一步两两比较,各浓度间的克隆形成率差异均具有统计学意义(均P<0.001)。经0、20、40、80、160μmol/L浓度的IWR-1-endo处理Huh7细胞24 h后,β-catenin的相对表达量分别为0.30±0.08、0.25±0.07、0.22±0.05、0.15±0.01、0.06±0.02,差异有统计学意义(F=247.00,P<0.001);与0μmol/L相比,80、160μmol/L浓度处理后的β-catenin的相对表达量差异均有统计学意义(P=0.014;P=0.008)。免疫荧光染色结果显示,与0μmol/L相比,80μmol/L IWR-1-endo处理后,Huh7细胞质和细胞核中的β-catenin表达均减少。结论Wnt通路抑制剂IWR-1-endo可通过抑制Wnt通路的活性抑制肝癌细胞Huh7的迁移和增殖,抑制作用均呈现剂量依赖性。

IWR-1对人肝癌细胞株Hep3B的增殖及Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用

目的探讨IWR-1对人肝癌细胞株Hep3B细胞增殖的影响及可能的机制。方法用不同浓度IWR-1(2、4、8、16μmol/L)处理Hep3B细胞,CCK-8法检测细胞生长抑制率;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;Western blot法检测细胞中蛋白表达的变化,实时定量RT-PCR检测β-catenin和c-myc m RNA表达的变化。结果 IWR-1对人肝癌Hep3B细胞的生长抑制作用呈现剂量和时间依赖性(P<0.01)。流式细胞术结果显示,Hep3B细胞的细胞周期呈现明显的G_0/G_1期阻滞,且细胞凋亡率明显升高(P<0.01),呈现剂量依赖性。IWR-1可引起β-catenin和c-myc m RNA表达下降,β-catenin、c-myc蛋白表达下降,而Axin 1和p-β-catenin蛋白表达上升。结论 IWR-1可以抑制人肝癌细胞株Hep3B的增殖,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现。

Wnt抑制剂IWR-1抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖和迁移

目的 :探讨Wnt抑制剂IWR-1-endo(简称:IWR-1)对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和迁移的影响,及可能的机制。方法 :用不同浓度的IWR-1(2、4、8和16μmol/L)处理MG-63细胞,CCK-8法检测IWR-1对MG-63细胞增殖的抑制率;FCM法检测MG-63细胞的周期及凋亡率;划痕愈合实验观察对MG-63细胞迁移能力的影响;实时荧光定量PCR法检测β连环蛋白(β-catenin)和cyclinD1mRNA的表达水平,蛋白质印迹法检测轴抑制蛋白1(axis inhibition protein 1,AXIN1)、β-catenin、磷酸化β-catenin和cyclin D1蛋白的表达水平。结果 :IWR-1对MG-63细胞的增殖抑制率随着药物浓度的提高和作用时间的延长而增强(P值均<0.01)。MG-63细胞周期呈现明显的G0/G1期阻滞(P值均<0.05),细胞凋亡率随着药物浓度的增加而显著升高(P值均<0.01)。IWR-1可明显降低划痕愈合率(P值均<0.01),可引起MG-63细胞内β-catenin和cyclinD1mRNA和蛋白表达水平下调(P值均<0.01),而使AXIN2和磷酸化β-catenin蛋白的表达水平上调(P值均<0.01)。结论 :IWR-1可以抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖及迁移,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

FSH及Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的增殖及雌激素分泌的影响

旨在研究Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞增殖及雌激素分泌的影响,探究其是否与促卵泡素(Follicular stimulating hormone,FSH)有关。在添加有FSH以及不同浓度Wnt信号通路抑制剂IWR-1的培养基中培养绵羊卵巢卵泡颗粒细胞168h,利用Guava ViaCount?Reagent测定细胞数目的变化,利用绵羊ELISA试剂盒检测雌激素浓度的变化,利用qRT-PCR检测FSH靶基因CYP19和CCND2的相对表达量差异。结果表明,无论有无FSH,抑制剂IWR-1使颗粒细胞数目显著减少(P<0.05);当有FSH时,抑制剂IWR-1的添加导致雌激素浓度显著降低(P<0.05)。IWR-1的浓度为1.0μmol·L-1时,对颗粒细胞的抑制效果最明显。IWR-1还导致CYP19和CCND2mRNA的表达量降低。综上表明,Wnt信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞的生物学功能具有促进作用,并且这种促进作用可能与FSH有关。

Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞向神经干细胞分化中的作用及机制研究

[目的]探讨Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向神经干细胞分化中的作用及机制。[方法]体外培养小鼠iPS,采用N2B27培养基联合维甲酸(retinoic acid,RA)诱导法,诱导其向神经干细胞分化;免疫荧光法检测iPS来源神经干细胞中的巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)的表达情况;将细胞分为正常组、Wnt3a组、Dickkopf相关蛋白-1(Dickkopf-1,DKK-1)组和IWR-1组,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)、Western blot分别检测iPS神经分化过程中Nestin、β-tubulinⅢ及β-catenin的表达情况;采用悬浮培养法检测Wnt/β-catenin信号通路对iPS来源神经干细胞增殖能力的影响。[结果]iPS来源神经干细胞表达神经干细胞的表面特异性标志物Nestin,以及早期神经元特异性标志物β-tubulinⅢ;iPS向神经干细胞分化过程中,Nestin、β-tubulinⅢ的表达均升高(P<0.05,P<0.05),β-catenin表达降低(P<0.05);采用Wnt3a处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较弱;采用DKK-1和IWR-1处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较强,且Nestin表达提高(P<0.01),β-catenin表达降低(P<0.05)。[结论]Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞诱导分化过程中受到抑制;采用DKK-1和IWR-1下调Wnt/β-catenin信号通路,可促进iPS向神经干细胞分化,提高iPS来源神经干细胞的增殖能力,提示Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞分化过程中具有负调控的作用。