人凝血IX因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达

人凝血ＩＸ因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达张克忠卢大儒邱信芳（复旦大学遗传学研究所上海２００４３３）黄英黄淑帧（上海市儿童医院医学遗传研究所上海２０００４０）血友病Ｂ（ＨｅｍｏｐｈｉｌｉａＢ）是由于人凝血ＩＸ因子（ｈ...

凝血IX因子复合物的研制

目的 :提高IX因子复合物的活性收率和IX因子复合物的血栓安全性。方法 :采用国产DEAE sepharosefastflow胶离子交换层析及Ca3(PO4 ) 2 吸附法 ,从新鲜冰冻血浆中直接制备凝血Ⅸ因子复合物。结果 :二步的收率分别为 ( 76 42± 4 48) %和 ( 74 31± 3 17) % ,制品的FⅨ :C的比活比传统Ⅸ因子复合物提高了约 2 0倍。结论

微小腺病毒载体介导的人凝血IX因子小基因的离体表达

将带有内源内含子的人凝血IX因子cDNA(hFIX小基因 )构建到不含腺病毒基因而只带有反向末端重复顺序 (ITR)和包装信号 ψ等顺式元件的微小腺病毒 (mini adenovirus)载体GT2 0 73上 ,得到载体GTi’IX。将该载体与带有lacZ报告基因的微小腺病毒载体 pRP10 0 1分别转移入腺病毒包装细胞 2 93Cre4中 ,随后再转染辅助病毒AdLC8,从而包装出微小腺病毒AdGTi’IX和AdRP10 0 1。经超离心纯化后对两种病毒的检测结果表明 ,病毒颗粒浓度分别为 2 4× 10 12 /ml和 2 2× 10 12 /ml,辅助病毒所占比例均小于 0 8% ;用AdRP10 0 1以感染复数 (MOI)为 5 0的比例转染 3T3细胞 ,X - gal染色后发现细胞蓝染率在 90 %以上 ;用AdGTi’IX以MOI =5 0的比例转染 3T3细胞 ,ELISA结果表明 ,其瞬时表达为 1 4μg/10 6细胞·2 4h。此结果显示出该载体系统在血友病B基因治疗方面有很好的应用前景 ,为进一步的动物试验及免疫原性研究等临床前研究奠定了良好的基础。

基于凝血因子IX基因剔除小鼠建立血友病乙转基因动物模型

为在凝血因子IX基因剔除小鼠基础上建立基因组中整合有含特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体的转基因小鼠家系 ,为血友病乙的研究提供更接近临床实际的动物模型。利用体外定点突变技术 ,构建含有特定点突变的人凝血因子IX基因表达载体 ,该载体包括由人凝血因子IX编码区及第一内含子构成的人凝血因子IX基因(hFIXml)、4个拷贝的MCK增强子 (MCKe)、鸡 β -肌动蛋白启动子 (bA)及PolyA ,命名为pMe4bAIXml质粒。将其线性化后 ,用显微注射法注射入 817只凝血因子IX基因剔除小鼠受精卵雄原核 ,再将它们分别回输 4 5只假孕受体母鼠的输卵管中 ,共产仔 6 9只 ,存活 6 3只。采用PCR与基因组Southern杂交筛选法鉴定小鼠 ,证实 6只小鼠基因组中整合有含特定点突变的pMe4bAIXml质粒 ,并对 1只小鼠的PCR产物进行测序 。

腺病毒载体介导的人凝血因子 IX 基因的离体和活体表达

为血友病Ｂ的基因治疗探索了高效转移和表达载体，建立了重组腺病毒载体介导的基因转移系统（Ａｄｈｆｉｘ），并进行了离体和活体表达研究。结果显示：腺病毒离体基因转移效率可达９８％以上并可在多种细胞中高效表达，ｈＦＩＸ蛋白最高可达６．８６μｇ／１０６细胞／２４ｈｒ。小鼠血浆中ｈＦＩＸ蛋白含量最高可达１０７２ｎｇ／ｍｌ血浆，并可持续表达１０周左右；以腹腔注射效果最好；免疫抑制剂环磷酰胺可明显延长表达持续时间。结果表明重组腺病毒载体可介导ｈＦＩＸｃＤＮＡ在离体细胞和活体组织中高效转移和表达。

人凝血因子IX在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ix（hFIX蛋白）在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFIX表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组hFIX。方法首先用RT-PCR将人肝脏hFIX的mRNA进行扩增、测序并插入到pPIC9K中载体，构建pPIC9K—hFIX酵母分泌表达载体，再将pPIC9K—hFIX电转化进入毕赤酵母SMDl168，然后通过G418抗药性能力的大小筛选获得高拷贝且表达量高的重组菌株。结果通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表明本研究获得的重组毕赤酵母hFIX表达量达到100mg／L；经过阴离子交换和半透膜扩散透析得到纯化的蛋白。检测重组hFIX的比活力，约为天然hFIX凝血活性的5．5％。结论我们可以优化找到更好的生产条件，使用其他比SMDll68更好的菌株，以获取更好生产量和质量；另外，我们也有很多可以增强在酵母生产的hFIX的活性。

腺病毒介导人凝血因子IX基因在小鼠脂肪干细胞中的表达

目的:探讨腺病毒介导的人凝血因子IX(hFIX)基因在小鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)中的表达。方法:体外分离培养小鼠脂肪干细胞,观察其细胞形态,CCK-8法测定其生长活力,流式细胞术鉴定其细胞表型CD29、CD90、CD45,成脂成骨诱导鉴定其分化能力。将携带hIX基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞,对比观察其与未转染时细胞形态及生长曲线有无变化。RT-PCR检测hFIX基因在细胞中的表达,Western blot检测细胞内及培养细胞上清液中hFIX蛋白的表达。ELISA法检测细胞上清液中的hFIX蛋白量(The antigen content of hFIX,FIX:Ag),一期法检测培养细胞上清液中hFIX蛋白活性(The clotting factor activity of hFIX,FIX:C)。结果:小鼠ADSC离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形,具有很强的折光性,贴壁生长时间为种瓶后4-6 h,种瓶后72 h细胞变为长梭形纤维状,呈漩涡状排列;第3代ADSC体外培养1-2 d生长速度较缓慢,3-5 d增殖速度增快,呈指数倍扩增,6-7 d生长速度逐渐缓慢,总体生长趋势呈S型;油红O对诱导后细胞进行染色,用倒置显微镜观察,可见红色脂滴形成。茜素红对诱导后细胞进行染色,用倒置相差显微镜观察,可见橙红色钙化骨节。第3代ADSC高表达CD29(99.91%),CD90(99.02%),几乎不表达CD45(0.94%)。RT-PCR结果显示,hFIX基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达。Western blot结果显示,小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达hFIX蛋白。ELISA测定转染ADSC培养上清FIX:Ag:第1 d为21.33±3.93 ng/(10^6 cells·24 h),第3 d为12.63±0.86 ng/(10^6 cells·24 h),第9 d为12.63±2.36 ng/(10^6 cells·24 h)。一期法检测培养细胞上清液中FIX:C为8.5%。结论:携带hFIX基因的腺病毒能有效转染ADSC。hFIX基因修饰的ADSC可以分泌具有凝血活性的hFIX蛋白。

中国人凝血因子IX基因研究

本文采用PCR和DNA测序技术对6例血友病B及其母凝血因子IX（FIX）基因缺陷进行了检测，发现5种点突变，其中3种属世界上未曾报道的新的点突变，分别命名为FIX重庆1，2，3。本文同时采用PCR和限制性内切酶酶解技术，对我国人群FIX基因限制性片段长度多态性进行了分析。发现两种有益的FLX基因多态性，其中MSe1-698位T/C基因频率分别为0.64和0.36.BstuI192A/G基因频率分别为0.81和0.19，该发现有利于我国人群中进行血友病B携带者筛查和产前基因诊断。

重组腺病毒介导的人凝血Ⅸ因子cDNA在奶山羊乳腺中的分泌表达

利用含ｈＦＩＸｃＤＮＡ和腺病毒片段的质粒ｐＡｄＣＭＶｈＦＩＸ与质粒ｐＪＭ１７共转染２９３包装细胞，制备含ｈＦＩＸ的重组腺病毒颗粒，经纯化、浓缩后通过直接转染活体奶山羊乳腺小叶的方法，建立了ｈＦＩＸ蛋白的乳腺表达系统。转染处理４天后，ｈＦＩＸ蛋白在羊奶中的最高表达量为２１ｎｇ／ｍｌ乳汁，活性检测表明乳汁中的人凝血ＩＸ因子蛋白８０％以上具有生物学活性。此研究结果证实了人凝血ＩＸ因子全长ｃＤＮＡ在奶山羊乳汁中分泌表达的可行性，同时也为验证外源基因在奶山羊乳腺组织中的分泌表达提供了一个快速检测系统。

人凝血Ⅸ因子cDNA在培养细胞中和转基因小鼠内的表达特性

将由ＳＶ４０早期启动子和小鼠金属硫蛋白基因启动子所控制的人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ的重组基因分别导入培养的小鼠成纤维细胞，发现它们都能被表达。进而将它们分别导入小鼠受精卵雄原核，作成相应的转基因小鼠，则发现它们都失去了表达特性，结果分析表明，在人凝血Ⅸ因子ｃＤＮＡ中可能存在着决定其在活体内表达的顺式调节元件。

D-二聚体、抗凝血酶Ⅲ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ检测对肝脏疾病诊断的意义

目的研究凝血因子、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)活性和D-二聚体(D-D)含量测定对肝脏疾病的诊断意义。方法对126例肝脏疾病患者和30例健康体检者的血浆样本用免疫比浊法测定D-二聚体含量,用凝固法测定凝血因子Ⅷ和Ⅸ活性;用发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ活性。结果肝癌组和肝硬化组血浆D-二聚体含量与健康对照组比较显著升高(P<0.05),而肝炎组与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);不同类型肝病患者凝血因子Ⅷ活性与健康对照组相比较显著升高(P<0.05),肝癌组凝血因子Ⅸ活性与健康对照组比较有显著升高(P<0.01),肝炎组和肝硬化组凝血因子Ⅸ活性与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),抗凝血酶Ⅲ与健康对照组相比均显著降低(P<0.01)。结论 D-二聚体含量、凝血因子Ⅷ活性增加和抗凝血酶Ⅲ活性降低是肝病患者疾病发展的敏感性指标,而凝血因子Ⅸ活性可能只是反映肝癌疾病的敏感指标。

人凝血因子Ⅸ基因cDNA在大肠杆菌中表达的初步报告

我们首次将人凝血因子Ⅸ基因cDNA亚克隆于原核细胞表达载体pKK233-2,以期获得人重组凝血因子Ⅸ。实验结果,我们得到重组表达质粒pKK233-FIX1和pKK233-FIX2,以IPTG诱导,在大肠杆菌JM103中表达出一特定的、与人凝血因子Ⅸ基因cDNA表达相关的蛋白质。ELISA定性实验表明:这一特定的蛋白质具有人凝血因子Ⅸ抗原性。此项研究为最终获得人重组凝血因子Ⅸ打下了基础。

第一批人凝血因子浓制剂国家标准品的协作标定

目的标定第一批人凝血因子Ⅸ浓制剂国家标准品。方法用 ＷＨＯ ９６／８５４批人凝血因子Ⅸ国 际标准品标定我国人凝血因子Ⅸ国家标准品，再用此标准品作对照检测国内生产的冻干人凝血酶原复合物，并分 别将标准品置４℃、３７℃和４５℃保存６个月考查其稳定性。结果各项检测指标均达到国家标准品要求，９．３ＩＵ／支； 检测１４批冻干人凝血酶原复合物ＦⅨ效价，其中１１批达到瓶签标示效价的５０％以上；标准品的稳定性良好。结论 已成功地制定第一批人凝血因子Ⅸ浓制剂国家标准品。

抗组胺药对慢性荨麻疹患者血浆TAT与FIX水平的影响

目的:观察抗组胺药对慢性荨麻疹(CU)患者血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)与凝血因子Ⅸ(FIX)水平的影响并探讨TAT、FIX与CU发病的关系。方法:用酶联免疫吸附法检测治疗前CU患者、抗组胺治疗症状控制后CU以及健康献血者血浆TAT与FIX的水平。结果:CU患者治疗前的血浆TAT水平(32.13±14.72 ng/mL)明显高于正常对照组(21.94±7.95 ng/mL)(P<0.01),抗组胺治疗症状控制后的血浆TAT水平(26.53±14.43 ng/mL)较治疗前下降,但组间比较无统计学差异(P>0.05);CU患者治疗前的血浆FIX水平(2.32±0.77μg/mL)低于正常对照组(4.25±1.16μg/mL)(P<0.01),抗组胺治疗症状控制后的血浆FIX水平(3.02±1.36 ng/mL)较治疗前升高(P<0.01),但尚低于正常对照组(P<0.01)。结论:CU患者血浆TAT水平升高,FIX水平降低,提示CU患者存在凝血系统激活以及FIX消耗,抗组胺药治疗后CU患者体内凝血状态向正常水平方向改变,但短时间用药症状控制后其凝血状态并不能立即恢复正常水平。

人凝血因子Ⅸ∶Ag酶联免疫测定法的建立

采用抗人凝血因子Ⅸ单克隆和多克隆两种抗体，建立了人凝血因子Ⅸ抗原（ＦⅨ∶Ａｇ）酶联免疫测定法（ＥＬＩＳＡ）。标准曲线相关系数为０．９９３（Ｐ＝０．００１，ｎ＝５），测定范围（６．２５～１００）Ｕ／Ｌ，最低检测量１．５Ｕ／Ｌ；批内及批间变异系数分别为７．２５％和４．７３％，回收率９９．７％；与人血浆中其它蛋白质未见交叉反应。测得２０人份正常人血浆中ＦⅨ∶Ａｇ为（１０２７±１７２）Ｕ／Ｌ，与ＦⅨ促凝活性（ＦⅨ∶Ｃ）测得值比较，差异无显著性（Ｐ＞０．５）。重症乙型血友病人血浆ＦⅨ∶Ａｇ测得值与临床诊断相符。

重组AAV1/hFIX病毒制备及其体外转导培养细胞的实验研究

目的制备携带人凝血因子IX基因的重组AAV1病毒(rAAV1/hFIX),体外转导C2C12细胞并检测hFIX的表达。方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1/hFIX,体外转导C2C12细胞后,检测细胞上清中FIX的表达量。结果制备出了高纯度的rAAV1/hFIX病毒,转导C2C12细胞24h后在上清中即可检测到hFIX,连续检测了120h都有表达,24h最高表达量高达到(68.0±3.2)ng/24h。结论制备的rAAV1/hFIX病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFIX,为应用基因治疗载体治疗血友病B的体内实验奠定了基础。

凝血因子Ⅸ制剂的研究进展

乙型血友病长期以来威胁病人的生命。多年来凝血酶原复合物(PCC)为该病的主要治疗药物:但因为PCC由大量混合血浆经简单工艺制备而成,制剂中混有未灭活的病毒和大量杂蛋白,因此,该制剂的使用存在一些问题,包括肝炎病毒、艾滋病毒等病毒感染和血栓形成等疾病发生。近几年,由于有效病毒灭活方法的应用和蛋白分离纯化工艺的改进和提高,已开发研制出高纯度、无病毒感染的制剂。本文着重介绍有关因子Ⅸ(FⅨ)的分子生物学特性、PCC的潜在问题,病毒灭活的方法及高纯度制剂的开发前景。

凝血因子Ⅸ无义突变真核表达载体的构建及其在COS-7细胞的表达

本研究以含有fⅨ cDNA的pcDNA3.1质粒为模板构建4种包含不同类型无义突变的fⅨ真核表达载体并进行鉴定,实现其在COS-7细胞中的表达。采用以PCR为基础的定点突变法体外构建fⅨ基因无义突变体,并通过DNA序列分析进一步鉴定证实;应用脂质体转化技术将野生型、突变型fⅨ表达载体分别瞬时转染COS-7细胞,采用实时定量PCR鉴定fⅨ mRNA在各组的相对表达水平。结果表明,4个突变型质粒除相应位点的无义突变外,未见其它突变,提示无义突变载体构建成功。实时定量PCR鉴定表明,各突变组真核表达载体已成功转染COS-7细胞株并能转录为mRNA。结论:采用以PCR为基础的定点突变法可在体外构建fⅨ真核表达载体,并可在COS-7细胞中表达,其转录过程中不引发mRNA降解,这为进一步研究无义突变引起FⅨ功能丧失及表达量降低的机制和治疗研究提供了物质基础。

人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH)polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。

第三代重组凝血因子制剂和基因治疗的前景

重组因子 和 制品具有确定的疗效和良好的安全性记录。然而 ,对病毒传播可能性的担忧促使人们研制不添加任何人源或动物性蛋白的重组制品。目前上市的第二代重组因子 浓制剂是 2 0 0 0年批准的。两种新的第三代制品正处于研制和临床试验中 ,它们在制备过程中没有添加任何人或动物来源的物质。另一种外源因子替代法是基因治疗 ,血友病的基因治疗正处于临床研究中。基因治疗涉及外源因子 或 基因的稳定插入和蛋白的长期表达和分泌。迄今为止所用的方法都是基于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒载体以及非病毒载体的电穿孔技术。三项基因治疗 期临床试验已于 2 0 0 2年结束 ,还有一项以上的试验仍在进行中。本文对近期用于血友病治疗的第三代重组制品和基因治疗的临床试验结果作一评述。