RNA干扰Id2基因表达抑制PC-3前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力

背景:Id基因是碱性螺旋-环-螺旋因子的内源性负性调节因子。该因子参与细胞的增殖、分化和生存,并在不同类型肿瘤的进展和浸润过程中表现出功能的多样性。目的:探讨沉默Id2基因表达对人前列腺肿瘤干细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:取对数生长期的PC-3人前列腺癌细胞,采用无血清悬浮培养法分离肿瘤干细胞球,流式细胞仪检测肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达。构建sh RNA-Id2表达载体,转染至前列腺肿瘤干细胞,以未转染的前列腺肿瘤干细胞为对照。转染后48 h,采用RT-PCR与Western blot实验检测前列腺肿瘤干细胞Id2基因及蛋白的表达;采用MTT法、Transwell小室检测前列腺肿瘤干细胞的增殖和侵袭能力;采用Western blot与RT-PCR检测前列腺肿瘤干细胞上皮标志物E-钙黏蛋白、间质细胞标志物波形蛋白及上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist的表达。结果与结论:(1)采用无血清悬浮培养法成功分离出肿瘤干细胞球,第3代前列腺肿瘤干细胞表面标记CD44^+CD24^-表达率为(85.69±8.96)%,显示培养的肿瘤干细胞球高表达肿瘤干细胞表型;(2)转染后48h,sh RNA-Id2转染组细胞Id2基因及蛋白表达明显低于未转染组(P <0.05),显示成功干扰了前列腺肿瘤干细胞Id2表达;(3)shRNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的增殖速度和侵袭能力低于未转染组(P<0.05);(4)sh RNA-Id2转染组前列腺肿瘤干细胞的上皮标志物E-钙黏蛋白表达高于未转染组(P<0.05),间质细胞标志物波形蛋白、上皮细胞-间充质转化调控转录因子Twist表达低于未转染组(P <0.05);(5)结果表明,RNA干扰Id2基因表达可通过调控E-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist表达抑制前列腺肿瘤干细胞的增殖及侵袭能力。

白血病患者白细胞中分化抑制因子Id2 mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id2基因在白血病白细胞中的表达状况。方法:应用RT-PCR半定量分析16例急性非淋巴细胞白血病(ANLL),10例慢性粒细胞白血病(CML)白细胞中Id2的mRNA表达水平。结果:Id2基因在急性非淋巴细胞和慢性粒细胞白血病患者外周血白细胞中的表达水平均增高,有统计学意义(P<0.05),但两者间比较无统计学意义。结论:Id2基因在白血病细胞中的表达明显增高,可能与白血病的发病有一定相关性。

外源性分化抑制因子Id2在C_2C_(12)细胞中的表达

目的:构建大鼠Id2基因真核荧光表达载体,并观察外源性Id2基因C_2C_(12)细胞中的表达。方法:RT-PCR扩增出Id2全长cDNA,T4 DNA连接酶将载体pGEM-T和Id2 cDNA进行连接,构建克隆载体,经限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-Id2克隆载体和pEGFP-C2真核表达栽体,构建出重组真核表达载体pEGFP-C2-Id2,经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序证实cDNA片段大小和序列的正确性;通过电穿孔转染法将外源性Id2基因导入C_2C_(12)成肌细胞中。分别于转染4、8、12、24、36、72 h后通过荧光倒置显微镜下观察细胞整体情况,并计算转染效率。结果:经酶切分析和序列测定证实pEGFP-C2-Id2含大小正确的正向Id2 cDNA片段,获得高转染率和高表达外源性Id2基因的C_2C_(12)细胞,转染8 h时,转染效率约为(10.5±2.8)%;转染12 h后,转染效率约为(20.9±3.1)%;转染24 h后,转染效率最高,约为(60.8±3.2)%。结论:成功构建了同时携带有G418筛选位点和Id2基因的真核表达载体;并获得高表达外源性Id2基因的C_2C_(12)细胞。

分化抑制因子基因沉默的人尤文肉瘤细胞系的建立

目的 应用短发夹RNA（shRNA）技术,构建分化抑制因子（Id2）基因稳定干扰的人尤文肉瘤细胞系,为进一步研究Id2在尤文肉瘤细胞生长、分化中的作用提供有用模型.方法 体外合成3条Id2序列特异性shRNA,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-Id2真核表达载体,通过脂质体转染尤文肉瘤RD-ES细胞,采用Western blot方法检测Id2蛋白表达水平,采用细胞计数法检测shRNA转染后对细胞生长的影响,采用流式细胞术检测转染前后细胞周期的变化.结果 Western blot结果显示,稳定转染shRNA-Id2-543及shRNA-Id2-593的RD-ES细胞中Id2表达水平降低,与对照组相比分别下降54％及57％;转染组细胞的生长速度明显减慢,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）;细胞周期S期细胞比例分别为（36.60±1.53）％及（44.89±2.46）％,高于对照组的（29.73±2.03）％,差异有统计学意义（P＜0.05）,G2期比例无明显变化甚至降低.结论 成功建立Id2基因沉默的人尤文肉瘤RD-ES稳定转染细胞系.Id2表达下调可抑制尤文肉瘤细胞增殖,细胞周期阻滞于S期.Id2可能在尤文肉瘤细胞生长增殖中扮演重要角色.