自制NSE单抗的鉴定及其双抗夹心ELISA方法的建立

目的:制备并鉴定NSE(Neuron-specific enolase)单克隆抗体,建立可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA方法。方法:用本实验室已表达纯化的NSE融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。采用WB、IP、IF、IHC等方法对获得的NSE单抗进行鉴定及亚型检测。利用辣根过氧化物酶标记纯化后的NSE单抗,建立一个可检测NSE蛋白的双抗夹心ELISA法。结果:通过分析和鉴定,选定2株可稳定分泌抗NSE抗体的杂交瘤细胞株,效价达4.2×107～6.5×107,亚型为IgG2b。免疫印迹结果显示,该抗体不仅能识别细胞内源NSE蛋白,还能识别分泌到细胞培养上清液中的NSE蛋白,此外还可用于免疫荧光及免疫组化检测。文中所建立的双抗夹心ELISA法,最低检测极限为8.85 ng/ml。结论:成功获得了效价高、灵敏度好及特异性强的NSE单抗,建立了一个双抗体夹心ELISA检测系统,具有良好的临床应用前景。

抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性

利用Gly m Bd 28K天然蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,取小鼠脾脏细胞与杂交瘤细胞融合,筛选出2株能稳定分泌抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3和2F4。体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体,经纯化后,得到2株均为Ig G1型的单克隆抗体m Ab1E3和m Ab2F4。间接ELISA方法测得m Ab1E3的效价达到1∶4.10×10~5,对Gly m Bd 28K蛋白的半数抑制率(IC_(50))为23.99μg·L^(-1),与花生蛋白、核桃蛋白等的交叉反应率均低于0.1%。该单克隆抗体的制备为Gly m Bd 28K致敏蛋白的检测以及抗原表位的鉴定奠定了基础。

抗猪隐孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

目的筛选特异性强、亲和力高的抗猪隐孢子虫(Cryptosporidiumsuis)单克隆抗体(McAb),并探讨其生物学活性。方法将纯化的猪隐孢子虫卵囊冻融和超声波处理后免疫BALB/c小鼠,取阳性免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;经间接ELISA法筛选,有限稀释法进行克隆;用间接ELISA叠加试验、间接免疫荧光试验鉴定McAbs的免疫反应活性。结果获得3株能稳定分泌抗猪隐孢子虫McAbs的杂交瘤细胞株,命名为1E1C5、1E11A5、2B7A1,分别属于Ig M、IgG3和IgG2a类;其细胞培养上清效价分别为1∶3200、1∶1600和1∶3200,小鼠腹水效价分别为1∶1.6×105、1∶1.6×105和1∶0.8×105;ELISA叠加试验表明3株单抗可识别两个不同抗原位点,1E1C5有较高的亲和力;免疫荧光试验结果显示3株单抗均能与猪隐孢子虫卵囊壁反应,但与艾美耳球虫、人隐孢子虫(C.hominis)有微弱的交叉反应。结论获得了3株可识别猪隐孢子虫卵囊壁的McAbs,为进一步开展猪隐孢子虫快速诊断研究奠定了基础。

人IgMμ链恒定区各肽段的基因合成原核表达及免疫原性分析

目的全基因合成并原核表达免疫球蛋白M的重链(IgMμ链)及其各肽段,与天然的IgM、IgMμ链和IgG进行免疫原性的分析比较,进一步了解IgMμ链恒定区的结构与功能。方法根据GenBank数据库IgMμ链恒定区(CH1-CH4)的cDNA序列并进行必要的大肠杆菌密码子优化,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)体外基因合成人IgMμ链恒定区全长(CH1-CH4)及其截断片段CH1-CH2和CH3-CH4。原核表达并纯化相应的3种融合蛋白PET32a-rMμCH1-CH4、PET32a-rMμCH1-CH2和PET32a-rMμCH3-CH4,并分别免疫BALB/c小鼠。同时设天然人IgM、IgMμ链和IgG免疫组为对照。再用ELISA法检测6种血清,分析比较其抗原性及免疫原性。结果利用OE-PCR方法体外成功合成1 359 bp的IgMμ链(CH1-CH4)全长基因、651 bp的IgMμ链CH1CH2和708 bp的IgMμ链CH3CH4,并构建相应原核表达质粒PET32a-rMμ1-4、PET32a-rMμ1-2和PET32a-rMμ3-4,血清ELISA检测结果显示:①IgG免疫原性>IgM>IgMμ链>rMμ1-4>rMμ1-2>rMμ3-4;②IgM免疫的血清与IgG有较强的交叉反应性,IgG免疫的血清与IgM也存在较强的交叉反应性;IgMμ链和重组μ链的各肽段免疫的血清与IgG均无明显的交叉反应性。结论重组的IgMμ链及其各肽段与天然IgMμ链有着相似的免疫原性和特异性,为基因工程得到抗人IgMμ链单克隆抗体奠定了研究基础。

抗口腔支原体、精氨酸支原体单克隆抗体的制备及其应用方法的初步研究

用口腔支原体、精氨酸支原体抗原免疫ＢＡＬＧ／ｃ小鼠，取其脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞（Ｓｐ２／０）融合，获得了７株稳定分泌抗口腔支原体单克隆抗体（ＭｃＡｂ），２株分泌抗精氨酸支原体ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株。间接ＥＬＩＳＡ测定其抗体效价可达１：１０３～１：１０７；９株ＭｃＡｂ中１株为ＩｇＧ２ａ，其余均为ＩｇＧ１。初步建立了ＥＬＩＳＡ检测支原体的方法。

抗重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备与鉴定

目的 :获得能特异性识别人红细胞生成素 (hEPO)的单克隆抗体 (McAb)。方法 :用重组人红细胞生成素 (rHuEPO)作抗原免疫Balb/c小鼠 ,以细胞融合、酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hEPO的杂交瘤细胞株。用生物学方法鉴定杂交瘤细胞 ,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果 :获得 3株稳定分泌抗hEPO McAb的杂交瘤细胞株 (1H7、4G11、1B4 )。培养上清的ELISA效价分别为 :1∶10 2 4、1∶5 12、1∶5 12 ;腹水效价为 :1× 10 7、1× 10 6、2× 10 4。阻断法表明 1H7识别的hEPO上的抗原决定簇和 4G11、1B4识别的不同。结论 :成功建立了 3株稳定分泌抗hEPO McAb的杂交瘤细胞株 ,它们分别识别hEPO上 2个不同的抗原位点 ,有望作为EPO定量检测的特异性抗体。

抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

为对猪瘟病毒（CSFV）建立更加有效的临床检测方法。用纯化的猪瘟兔化弱毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA方法筛选和3次亚克隆,最终获得了5株能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为：C7,C9,G9,G10和4E8,其分泌的单克隆抗体（McAb）为IgG1（G9,4E8）和IgG2a（C7,C9,G10）亚类。经鉴定,5株单抗细胞培养上清效价为1∶1 600-1∶3 200,腹水效价为1∶51 200-1∶102 400。交叉试验及特异性抗原阻断试验表明,所制备的McAb与其他抗原无交叉反应性,均完全针对猪瘟病毒（CSFV）抗原决定簇,具有高度特异性。稳定性试验表明,制备的杂交瘤细胞株经连续传代25代和经3次冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体。抗CSFV McAb的成功制备,为进一步研究CSFV的生物学特性及其快速诊断方法的建立奠定了基础。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。

单增李斯特菌P60单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备并筛选单增李斯特菌P60特异性单克隆抗体,初步建立其快速检测方法。方法以体外表达并纯化的李斯特菌P60蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗李斯特菌P60的McAb,鉴定其抗体亚型,并对单抗的腹水效价、稳定性及亲和力进行分析。用纯化的单克隆抗体包被酶标板,结合生物素化处理的P60多克隆抗体,夹心ELISA筛选单增李斯特菌特异性单抗,并以重组P60为标准品,建立标准曲线。结果获得了4株可稳定分泌P60单克隆抗体的杂交瘤细胞株。ELISA检测表明,筛选的6C2单克隆抗体株可特异性与单增李斯特菌(4b)P60反应。结论建立的夹心ELISA方法可对单增李斯特菌进行特异性鉴别和定量检测。

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明:成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。

脑心肌炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备脑心肌炎病毒(EMCV)的单克隆抗体,并对其进行鉴定。应用杂交瘤细胞技术,将灭活EMCV免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,HAT选择培养、间接ELISA法筛选和多次克隆化,筛选出稳定分泌抗猪EMCV的杂交瘤细胞株,并对其分泌的单克隆抗体进行了亚型、效价、特异性和细胞株染色体核型的分析。结果获得了1株能分泌抗EMCV单克隆抗体的细胞株,命名为EMCV Y1G9,其分泌的抗体亚型为Ig G2b类;腹水效价可达3.2×104;细胞株的染色体核型分析结果是染色体众数为92±2,单抗的特异性也较好。制备出了具有良好特异性和敏感性的抗EMCV的Mc Ab,为建立EMCV的特异性检测方法及该病的防制奠定了基础。

C型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定

将灭活的C型FMDV背部皮下多点注射免疫BABL/c小鼠,取小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞在PEG1 500作用下融合,用有限稀释法进行亚克隆.以C型FMDV重组VP1蛋白为抗原,间接ELISA法筛选单抗.以O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒为抗原,间接ELISA法检测单抗特异性.获得2株抗C型FMDV的单抗3B3和6D5,亚型鉴定为IgG1、IgG3;腹水效价分别为1∶25 600和1∶51 200;中和效价分别为1∶1 280和1∶640;2株单抗与O、Asial、A型FMDV以及猪水疱病病毒间无交叉反应,表明这2株单抗为高特异性抗C型FMDV单抗.研究结果可为C型FMD的诊断及预防提供基础材料,也可用于病因学及免疫学研究.

抗犬Ⅰ型腺病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

为制备抗犬I型腺病毒单克隆抗体,将犬I型腺病毒(CAV-I)细胞培养液饱和硫酸铵沉淀,差速离心浓缩,氯化铯密度梯度离心的方法纯化后免疫BALB/c小鼠,三免后效价过1:10000即可取脾细胞与SP2/0细胞在聚乙二醇(PEG)作用下融合,通过间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法亚克隆,制备单克隆抗体,并对制备完成的单克隆抗体进行生物学特性鉴定。获得2株能稳定分泌抗CAV-I的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为C8、E9,经鉴定其亚型分别为IgG1和IgG2a。间接ELISA检测效价,2株单抗细胞上清液效价为1:3200～1:6400,腹水效价为1:25600～1:51200。该单克隆抗体与CDV、FPV、FCV病毒均无交叉反应。实验成功制备了抗CAV-I单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。

栀子苷单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备特异性的栀子苷(Geniposide,GEN)单克隆抗体。方法:采用高碘酸钠氧化法合成栀子苷免疫抗原,通过对BALB/c小鼠进行免疫;对血清进行检测阳性后,取上述免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14按10∶1的比例融合;用间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;用阳性细胞株诱导制备腹水抗体;用辛酸硫酸铵法纯化抗体,并进行交叉反应检测。选择血清效价高且敏感性好的小鼠,采用杂交瘤细胞技术进行细胞融合,筛选分泌栀子苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用体内诱生腹水法制备栀子苷单克隆抗体,并通过正辛酸纯化的方法纯化腹水中抗体蛋白,采用SDS-PAGE法对抗体蛋白的纯化纯度进行检测。结果:获得了能分泌抗栀子苷单克隆抗体稳定的杂交瘤细胞株。SDS-PAGE结果说明经过纯化腹水中大量的杂蛋白能够被除去,获得的栀子单克隆抗体纯度较高,纯化后腹水中抗体效价与纯化前比均为60 000∶1左右。结论:成功获得了能分泌栀子苷单克隆抗体稳定的杂交瘤细胞株,特异性、灵敏度都比较高,为样品中的栀子苷快速微量检测及免疫亲和色谱柱的制备奠定了基础。

抗多环芳烃单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的本研究制备了2株抗多环芳烃单克隆抗体,并对其免疫学特性进行了初步鉴定。方法以芘丁酸(PBA)为半抗原,采用活性酯法分别与BSA和OVA偶联合成免疫抗原和包被抗原,4次免疫Balb/c小鼠后,选择抗体效价1∶25 600的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞采用PEG进行细胞融合。ELISA法筛选阳性细胞株,有限稀释法进行亚克隆,体内诱生腹水法制备单克隆抗体。抗体经Protein G亲和纯化后,SDS-PAGE检测抗体纯度,测定抗体水平和亚类。间接ELISA法测定抗体效价、亲和力常数;竞争ELISA法测定2株抗体特异性和交叉反应率。结果 PBA-BSA免疫成功,共获得2株可稳定分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为#1、#6-B7。2株单克隆抗体纯化后经鉴定为Ig G1亚类,质量浓度分别为4.1和3.6 mg/ml,效价分别为1∶25 600和1∶51 200,亲和常数分别为7.52×108和1.25×109。结论 2株抗体均对高环PAHs具有较高的交叉反应率,而无法识别低环的PAHs。

牛分枝杆菌CFP-10单克隆抗体的制备及其竞争ELISA方法的建立与应用

【背景】牛结核病是一种重要的人兽共患传染病,主要由牛分枝杆菌引起,阻碍养殖业发展,并在世界范围内造成巨大经济负担。【目的】制备牛结核分枝杆菌CFP-10蛋白单克隆抗体,建立牛结核病竞争ELISA方法并对其进行初步应用与评估。【方法】以rHis-CFP-10蛋白作为免疫原,采用小鼠杂交瘤融合技术获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,选用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体,并对其纯化后进行辣根过氧化物酶标记。基于CFP-10单克隆抗体建立牛结核病竞争ELISA方法,对155头奶牛采用商品化BOVIGAMTM试剂盒与建立的竞争ELISA检测方法进行同步检测,验证该方法适用性。【结果】获得一株稳定分泌CFP-10特异性抗体的阳性杂交瘤细胞株8E6,获得酶标抗体HRP-8E6并建立竞争ELISA方法。棋盘法确定包被抗原CFP-10-ESAT-6融合蛋白的工作浓度和酶标抗体HRP-8E6的稀释倍数分别为0.75μg/mL和1:8000,该方法Cut-off值为47.10%,检测限为0.800μg/mL;其重复性良好,批间与批内试验变异系数均小于10%;敏感性为54.55%,特异性为100.00%。临床检测显示,与BOVIGAMTM试剂盒相比,阳性符合率为78.57%,阴性符合率为82.35%,总符合率为80.65%。【结论】制备一株CFP-10特异性抗体,并使用特异性高的CFP-10-ESAT-6融合蛋白建立竞争ELISA检测方法,该方法准确、可靠,可应用于牛结核病的检测。

用单克隆抗体对牛型结核杆菌早期培养物进行菌型鉴定的研究

用抗牛型结核杆菌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）１Ａ３和抗牛型结核杆菌免疫血清经酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）对１９种分支杆菌参考株进行检测，证明了抗牛型结核杆菌ＭｃＡｂ１Ａ３的特异性和抗牛型结核杆菌免疫血清（ＩＭＳ）的相对非特异性。用ＭｃＡｂ１Ａ３对３６株分支杆菌临床分离株的早期培养物（培养３周）进行菌型鉴定，所需菌量最少仅２×１０７，即可鉴定出临床分离株中的牛型结核杆菌，敏感性和特异性均为１００％。此方法较常规微生物鉴定方法简单、省时，是一种有发展前途的菌型鉴定方法。

二乙酰精胺(DAS)单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]运用杂交瘤技术制备二乙酰精胺(DAS)单克隆抗体,并对其进行鉴定及应用研究。[方法]通过小鼠制备DAS单克隆抗体,对抗体进行ELISA和POCT法进行鉴定。制备免疫比浊法试剂进行验证。[结果]获取特异性单克隆抗体,经鉴定制备出的DAS单克隆抗体纯度合格且稳定性好,制备了DAS免疫比浊试剂盒。二乙酰精胺(DAS)在184例肠癌中的检出率为65.22%;CEA在170例肠癌中的检出率为40.00%;AFP在93例肠癌中的检出率为2.15%;CA199在166例肠癌中的检出率为17.47%;CA724在30例肠癌中的检出率为50%;CA125在87例肠癌中的检出率为14.94%。[结论]制备出的DAS单克隆抗体可作为诊断肠癌的标志物,结合其他标志物指标具有临床诊断价值。

甘草酸单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备特异性的甘草酸(GA)单克隆抗体。方法:用合成的甘草酸-牛血清白蛋白(GA-BSA)人工抗原免疫BALB/c小鼠;待血清检测阳性后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按10∶1的比例融合;用间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;用阳性细胞株诱导制备腹水抗体;用辛酸硫酸铵法纯化抗体,并进行交叉反应检测。结果:获得了稳定分泌抗甘草酸的单克隆抗体杂交瘤细胞株GA-Mab-DF5,腹水抗体纯化后纯度达98%,回收率达80%。线性检测范围为4～64μg.mL-1,R2=0.9986,并且与BSA、明胶、胆酸、去氧胆酸、芍药苷、黄芩苷等无交叉反应。结论:成功获得能稳定分泌甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株,灵敏度、特异性均较高,为样品中甘草酸的快速微量检测及免疫亲和色谱柱制备奠定了基础。

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。