系统性红斑狼疮患者血浆IgG N-糖基化水平与疾病活动度的相关性分析

目的探讨SLE患者IgG N-糖基化水平与疾病活动程度的相关性。方法采用回顾性病例-对照研究。结果SLE病例组中的IgG单半乳糖基化(G1)、双半乳糖基化(G2)和单唾液酸化(S1)水平均低于对照组;G2(t=2.68,P=0.008)和FG2(t=2.56,P=0.011)与SLE活动度呈负相关。结论IgG双半乳糖基化水平与SLE患者疾病活动度具有相关性。

系统性红斑狼疮女性患者IgG N-糖基与红细胞分布宽度的关联性研究

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)女性患者的免疫球蛋白G N-糖基(IgG N糖基)与红细胞分布宽度(red blood cell distribution width,RDW)之间的关系,为后续SLE联合标志物提供理论基础。方法选取2018年10月—2020年5月在山东省聊城市人民医院风湿免疫科门诊确诊及住院的341例SLE女性患者为研究对象,采集血液样本进行血常规检测并提取纯化血浆IgG,采用超高液相色谱法检测血浆IgG N-糖基水平。IgG N-糖基与红细胞分布宽度的关联性分析采用Spearman秩相关与logistic回归分析。结果RDW高水平组中的半乳糖基化及唾液酸化水平显著低于RDW低水平组。logistic回归分析结果显示,GP12、GP14、GP18与GP23为RDW升高的保护因素,高水平的GP4与GP8为RDW升高的危险因素。结论SLE女性患者IgG N-糖基与RDW存在关联性,异常的IgG N-糖基化可能是影响RDW水平升高的因素,为后续二者联合指标对疾病进行早期诊断或反映疾病情况的研究提供了理论基础。

N-琥珀酰亚胺-3-碘[^(125)I]苯甲酸酯标记人IgG

研究能有效降低抗体的体内脱碘的标记方法。碘标记N-琥珀酰亚胺-3-(三正丁基锡)苯甲酸酯(ATE)前体,得到N-琥珀酰亚胺-3-碘[125I]苯甲酸酯(S125IB),分别与人IgG和抗人肝癌单抗(Hepama-1)进行偶联,探索最佳标记条件,并测定标记物的稳定性和生物活性,研究直接标记和间接标记的Hepama-1在正常小鼠体内的生物学分布。结果表明,用N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)法125I标记ATE前体,在ATE用量为25～100μg、NCS用量为10～20μg、磷酸盐缓冲溶液(PBS)用量为10～20μL、反应时间为5 min时,标记率大于95%;S125IB和人IgG的偶联率最高可达75%,偶联产物稳定性、生物活性良好;与Hepama-1偶联率可达75%以上。生物分布的对比实验证明,1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯甘脲(Iodogen)直接标记的Hepama-1在甲状腺的放射性摄取率(脱碘显示)最高是S125IB间接标记的Hepama-1的87.9倍。这说明以ATE为前体的放射性碘间接标记蛋白质方法与传统的碘直接标记方法相比较,在解决体内严重脱碘问题上具有明显的优越性。

离线二维色谱结合糖苷外切酶酶解用于IgG与人血清糖蛋白中N-糖链的结构表征

基于离线二维色谱和糖苷外切酶分析,建立了一种有效、可靠的糖蛋白N-糖链的结构鉴定方法。首先采用弱阴离子交换色谱实现不同唾液酸程度糖链的制备,随后将激光诱导毛细管电泳(CE-LIF)与糖苷外切酶相结合进行糖链结构鉴定。将分离制备后的糖链荧光标记后,进行自上而下的消化(top-down digestion)以及自下而上的结构归属(bottom-up identification),共检测到IgG中的18种糖型。将上述策略进一步应用于人血清中N-糖链的分析,发现不同唾液酸化程度糖链的相对量为S1:S2:S3:S4=4.7:20.9:6:1。结果表明,人血清中高丰度的中性糖链与IgG的中性糖链结构非常相似,而血清中含量最丰富的是二唾液化两天线的N-糖型FA2G2S2。该方法在糖蛋白N-糖链的结构表征中具有一定的应用潜力。

类风湿性关节炎的IgG N-糖基生物标志物筛选

目的:探索血浆免疫球蛋白G(IgG)N-糖基作为类风湿性关节炎诊断生物标志物的能力。方法:采用病例对照研究,研究对象选自2014年在中国河北唐山冀东油田医院的体检人群,以是否患有类风湿性关节炎分为病例组(n=123)和对照组(n=195),采集血液样本并提取纯化血浆IgG,采用超高液相色谱法检测血浆IgGN-糖基。组间糖基结构比较采用两独立样本t检验或Mann-WhitneyU秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义;采用逐步回归分析及受试者工作特征曲线(ROC)筛选和评估血浆IgGN-糖基作为疾病生物标志物的能力。结果:类风湿性关节炎组的GP1、GP2、GP4-GP6、GP11、GP19、GP22和GP24含量均高于对照组(P均<0.05),GP9、GP12-GP18和GP20的含量均低于对照组(P均<0.05),差异均具有统计学意义。经逐步回归筛选得到4个糖基分别为GP1、GP2、GP4和GP24,单个糖基指标诊断效力中GP1(AUC=0.880,95%CI0.836~0.925)最大;糖基指标联合诊断效力达到0.919(95%CI0.883~0.954)。结论:血浆IgGN-糖基可以作为类风湿性关节炎的诊断生物标志物。

基于量子点标记技术的免疫层析法检测新型冠状病毒N蛋白IgG抗体研究

背景基于目前新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19),早诊断、早隔离、早治疗是防控传染的重要方法。建立方便快捷的免疫层析检测技术,对于防控SARS-CoV-2的传播十分必要。目的建立基于量子点标记技术的免疫荧光层析法检测抗SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗体的方法,判断被检测者是否感染过SARS-CoV-2或者是否接种过SARS-CoV-2灭活疫苗。方法2020年8月将制备好的鼠抗人二抗和抗N蛋白抗体固定至硝酸纤维素(NC)膜上,分别作为检测线(T)和质控线(C),然后将量子点标记的SARS-CoV-2 N蛋白均匀喷洒在玻璃纤维上,干燥后组装、切割、包装成试纸条。用该试纸条分别检测35例COVID-19患者和50例健康人的血清,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒初筛结果作为对照,计算量子点荧光免疫层析法的检测特异度和灵敏度,并利用N蛋白抗体标准品检测试纸条灵敏度。结果本研究制备的试纸条特异度为100.00%,灵敏度为94.29%,灵敏性为8.53~17.06 ng/ml抗体浓度。结论采用量子点标记技术检测血清中的抗N蛋白IgG抗体,操作简单、快速,灵敏度及特异度强。

Expression of TTV-ORF2 Protein for Detection of Anti-TTV IgG Antibodies in Human Sera

The present study describes the cloning and expression of ORF-2 region of TTV genome and the use of expressed peptide in developing immunoassay for detection of anti-TTV antibodies in serum. Presence of TTV-DNA in serum was detected by PCR amplifying N-22 region of ORF-1 of TTV genome. This was followed by genotyping of TTV by RFLP using N-22 amplicon. Using genotype-1 positive serum as the source of TTV, the ORF-2 region was amplified by PCR and subsequently cloned and expressed in pET-19b vector. The expressed protein, identified as 20 kDa protein on SDS-PAGE gel, was purified by affinity chromatography and then used as antigen to develop western blot assay for detection of anti-TTV antibodies in serum. Analysis of sera for anti-TTV antibodies and their comparison with presence of TTV-DNA, produced encouraging results. There was a good relation between presence of anti-TTV and TTV-DNA in these sera samples. Anti-TTV antibodies could be detected in all TTV-DNA positive sera irrespective of the presence of TTV-genotype. This investigation demonstrates that ORF-2 peptide may be used in developing immunoassay for identification of TTV infection.

检测人血清中SARS冠状病毒IgG抗体的ELISA方法建立及其应用

为了建立方便、敏感和特异的SARS病毒血清学诊断方法 ,利用PQE30表达系统在大肠杆菌M1 5中分段高效表达了SARS病毒N蛋白。通过金属鏊合亲和层析纯化了目的蛋白N - 1和N - 2 ,Westernblot结果显示 ,两个表达蛋白均具有较好的抗原性。然后将N - 1和N - 2蛋白共同包被 ,建立了检测人血清中SARS病毒IgG抗体的间接ELISA法。用此方法检测 1 2 0例临床诊断为SARS的病人和 2 4 4个不同年龄组正常人血清IgG抗体 ,结果 1 2 0例SARS病人的第一份血清IgG抗体总阳性率为 6 0 0 % ,发病第 0～ 7、8～ 1 0、1 1～ 1 4、1 5～ 2 7和 2 8天后的血清中 ,SARS病毒IgG抗体阳性率分别为 0、1 1 1 %、6 0 0 %、6 0 5 %和 70 3% ;而 2 4 4份正常人血清检测结果均为阴性 ,包括 1 0 0份1 4岁以下儿童血清也未发现假阳性。结果表明 ,利用大肠杆菌表达的N蛋白完全能够替代全病毒灭活抗原 ,所建立的间接ELISA方法简单 ,价格低廉 ,能保证生物安全 ,对SARS可疑病例的确诊和排除具有重要的实际应用价值 ,可用于SARS高危人群的血清流行病学监测 ,SARS疫情的控制和预防 。

胶体金免疫层析检测犬、猫抗狂犬病病毒IgG抗体的研究

目的建立检测犬、猫抗狂犬病病毒(RV)IgG抗体的胶体金免疫层析方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金用以标记SPA,同时将重组RVN蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,制备一种检测犬、猫抗RVIgG抗体的胶体金检测卡,进行了特异性和灵敏度试验,并与ELISA同时检测临床样品、统计结果。结果 GICA试纸条检测灵敏度为0.5IU/mL,与犬瘟热病毒、犬细小病毒等阳性血清无交叉反应,并与ELISA相比,两者的符合率为94.6%。结论成功建立了检测犬、猫抗RVIgG抗体的通用型胶体金免疫层析方法 ,该方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,操作简便,可广泛应用于基层。

抗禽流感病毒H5N1亚型单克隆抗体制备初报

目的制备禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体,为相关研究提供工具。方法以禽流感H5N1亚型病毒免疫BALBc小鼠,取其脾细胞和SP20细胞融合,用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫反应(ELISA)检测培养上清,并将阳性融合细胞稀释克隆化3次直至100%孔均为阳性,筛选阳性克隆株,运用免疫荧光法评估单克隆抗体检测病毒感染的犬肾细胞(MDCK)。结果得到三株稳定分泌抗体的细胞并命名为F8、F9、G11,抗体亚型鉴定结果分别为IgG1、IgG2a和IgG2b;在免疫荧光法单克隆抗体能够检测出感染MDCK细胞的病毒。结论建立了3株抗禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体细胞株,其产生的一株高特异性的McAbG11能够用于H5N1亚型禽流感病毒感染诊断,并可能应用于禽流感病毒H5N1亚型感染的防治。

新试剂N－（β－羧基丙酰基）异鲁米诺标记抗体的研究

新化学发光免疫分析试剂Ｎ－（β－羧基丙酰基）异鲁米诺在水溶性碳二亚胺的脱水作用下，分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基可缩合形成肽键；将其用于标记羊抗人抗体，标记率为０．２８，标记反应条件温和、时间短，标记抗体免疫活性无明显变化，基本不影响其化学发光效率．

N-琥珀酰亚胺-4-^(18)F(氟甲基)苯甲酸酯的合成

合成了18F标记蛋白常用中间体N 琥珀酰亚胺 4 18F(氟甲基 )苯甲酸酯 (18F SFMB) ,用操作简单的Sep Pak硅胶柱代替了繁琐耗时的HPLC分离。探讨了反应溶剂、温度、K/ 2 2 2与K2 CO3 的摩尔比及反应时间等诸因素对18F SFMB放化合成的影响。得出较佳标记条件 :以无水乙腈为溶剂 ,K/ 2 2 2与K2 CO3 摩尔比为1,80℃下反应 5min ,标记率为 5 7% ,比文献值提高了 3倍以上。对IgG进行了标记 ,在室温下反应 15min ,标记率可达 88%。

弓形虫抗血清 IgG 的制备及其检测效果研究

目的比较弓形虫不同免疫原所制备抗血清 IgG 的检测效果,优选高效价的抗体诊断试剂。方法制备弓形虫的细胞质抗原(C)、代谢抗原(S)。用抗原 C、C+S、S 及活虫(P)各免疫2只家兔,收集抗血清经纯化而获得 IgG 抗体(多抗)并制备酶标记抗体;用上述4种多抗与对应的多抗-HRP 组合成4种双抗体夹心型 ELISA,检测人血清 CAg 和 C、S 抗原,评价试剂的敏感性;抗血清与疟原虫、隐孢子虫等抗原进行交叉反应性试验,评价试剂的特异性;采用捕获法检测人血清 IgM 抗体,比较4种多抗-HRP 的检测效果。结果各种 ELISA 夹心法同步检测 CAg 阳性标本7例,阴性样本8例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 比值依次为 C+C 组33.5、S+S 组27.8、CS+CS 组21.2、P+P 组13.2;C 和 S 抗原的最低检出量均为0.5μg/ml;与其它寄生虫未出现交叉反应。4种多抗-HRP 同步检测IgM 抗体阳性标本3例,阴性样本7例,均未出现假阴性和假阳性反应,其 OD 均值的 P/N 值最高的是抗 C-HRP。结论 4种抗体用于检测人血清 IgM 抗体、CAg、C 和 S 抗原以及其它抗原的结果表明,各种抗体试剂均具有良好的敏感性和特异性,其中以抗 C 抗体试剂最为满意。(2)4种组合形式的夹心ELISA,检测弓形虫抗原的差异无统计学意义,表明弓形虫 C 和 S 抗原间存在着共同抗原成分。

抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体制备及性质初步研究

目的:制备抗重组SARS病毒N蛋白单克隆抗体。方法:重组SARS病毒N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠获得免疫脾细胞,利用杂交瘤技术将免疫脾细胞同骨髓瘤Sp2 /0细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性克隆并扩增。结果:获得了能稳定分泌抗重组SARS病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,经鉴定分泌的抗体IgG亚类为IgM。结论:制备了鼠源性单克隆抗体并初步研究了该抗体性质。

结核分枝杆菌IgG/IgM抗体、正五聚蛋白3及肝素结合蛋白对肺结核患者病情动态演变的监测价值

目的探讨结核分枝杆菌IgG/IgM抗体、正五聚蛋白3(PTX3)及肝素结合蛋白(HBP)对肺结核患者病情动态演变的监测价值。方法前瞻性选取2018年11月至2019年11月青海省传染病专科医院收治的肺结核患者60例(肺结核组)、潜伏感染患者50例(潜伏感染组)、健康体检者50例(正常对照组)为研究对象。比较痰涂片培养法和结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测法诊断肺结核的准确性。比较3组对象结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测阳性率,外周血中PTX3、HBP的mRNA和蛋白含量。将肺结核患者分为有空洞组和无空洞组,比较2组间血清PTX3和HBP含量及结核分枝杆菌IgG/IgM抗体的表达水平。所有初治肺结核患者均接受规范治疗,治疗前、治疗3个月和6个月后,检测患者外周血中PTX3、HBP的mRNA和蛋白含量,以及结核分枝杆菌IgG/IgM抗体的表达水平。结果结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测法准确率为97.8%,高于痰涂片培养法的检测准确率(73.9%),差异有统计学意义(P<0.05)。肺结核组血清中抗结核抗体显著高于潜伏感染组和正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。潜伏感染组与正常对照组外周血中PTX3、HBP的mRNA及蛋白含量相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。有空洞组肺结核患者血清中PTX3、HBP的含量显著高于无空洞组(P<0.05)。治疗3个月和6个月后,肺结核患者外周血中PTX3、HBP的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),且治疗6个月降低幅度明显大于治疗3个月。结论结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测,阳性检出率高,有助于初治肺结核的病情诊断,但对患者病情动态演变的监测价值不大。PTX3和HBP的表达是初治肺结核诊断和病情动态演变监测的敏感指标。

基于超高压液相色谱评价不同保存时间对人血浆免疫球蛋白G N-糖基化水平的影响

目的:探讨超低温环境下不同储存时间对血浆免疫球蛋白G(IgG)N-糖基化水平的影响,以期为大规模流行病学调查中有效保存样本提供帮助。方法:采用随机数表法收集超低温环境下(-80℃)保存于2012年、2013年、2017年、2018年和2019年5个年份的75份女性健康体检的血浆样本,并将其按照不同保存年限分为2012年组、2013年组、2017年组、2018年组和2019年组。采用基于超高压液相色谱平台,对5组血浆样本中的总体IgG N-糖基化水平进行高通量检测,分离出24个糖基结构,并计算其衍生物结构含量。采用方差分析或秩和检验对不同储存时间组的糖基检测结果进行差异性比较。结果:对超低温环境下不同保存时间保存的5组血浆样本中IgG N-糖基结构进行比较,24个糖基结构的检测其色谱峰(GP1~GP24)均无统计学差异;对5组样本中13个IgG N-糖基衍生物结构含量比较均无统计学意义。结论:超低温条件下,血浆样本存储时间的长短对血浆中IgG N-糖基化水平未产生明显的影响。

疟疾患者血浆IgG N-糖基化水平异常修饰的病例对照研究

目的 探索疟疾患者与健康人群血浆中免疫球蛋白G(IgG)N-聚糖表达水平的差异性。方法 选择山东省2022年10月-2023年6月确诊的输入性疟疾(排除合并细菌感染)患者27例,健康对照组采用倾向性评分1∶1匹配,最终纳入55例。抽取受检者静脉血,肝素抗凝,分离血浆,提取IgG,采用超高液相色谱法检测IgG N-糖基组。组间糖基结构比较采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果 55例受检者的年龄范围为27(56岁),平均年龄(41.64±8.64)岁。疟疾病例组患者血浆GP4、GP6、GP14、GP17和GP19的聚糖水平均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01);GP5、GP8、GP9、GP11、GP13-GP18、GP20、GP21、GP23和GP14的聚糖水平均显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。IgG无半乳糖基化(G0)水平疟疾病例组为(28.42±7.07),健康对照组为22.34±5.54;IgG单半乳糖基化(G1)水平疟疾病例组为25.61±4.08,健康对照组,32.85±2.71,差异有统计学意义(P<0.05);IgG双半乳糖基化(G2)水平疟疾病例组为23.35±4.45,健康对照组为19.93±3.01,差异有统计学意义(P<0.05)。双唾液酸指标S2疟疾病例组为(3.73±0.92),健康对照组为5.72±2.23,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 疟疾患者血浆IgG单半乳糖基化和唾液酸化明显减少,提示可能与疟疾发病有关。

妊娠合并重症新型甲型H1N1流感患者抗H1N1抗体IgG亚类的分布

目的探讨妊娠合并重症甲型H1N1流感患者抗H1N1抗体各IgG亚类在血清中的分布特点。方法收集2009年11月14日-12月31日,确诊的女性甲型H1N1流感患者,分为妊娠病例组,非妊娠病例组,同时收集抗甲型H1N1抗体阳性的健康妊娠女性作为妊娠对照组,采用ELISA法检测各组血清特异性IgG及亚类的百分结合率。结果妊娠病例组的IgG2I、gG3I、gG4亚类的百分结合率中位数分别为53.0%、65.0%、61.6%,均低于妊娠对照组,差异有统计学意义(P<0.05);各组的特异性抗甲型H1N1 IgG均以IgG1亚类为主,为>70.0%,妊娠病例组的IgG2亚类占5.0%,低于非妊娠病例组的10.0%和妊娠对照组的8.0%,(P<0.05)。结论妊娠合并甲型H1N1流感患者中,特异性抗甲型H1N1 IgG以IgG1亚类为主,IgG2亚类的绝对及相对下降与甲型H1N1感染相关。

SARS-CoV核衣壳蛋白的表达与免疫研究

依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成编码SARS病毒N蛋白的全基因(1296bp)序 列,再与设计的CTL特异性表位基因(195bp)重组后,克隆到pET-28a(+)质粒中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达。利用SARS患者恢复期阳性血清,鉴定表达蛋白。进一步纯化后免疫马,并用ELISA方法检 测血清抗体效价。结果显示SDS-PAGE表明所表达的蛋白相对分子质量约为55000 Da,与预计大小相符;Western blot显示表达的蛋白具有良好的抗原性和特异性。对表达蛋白形成的包涵体进行洗涤,得到的蛋白纯度可达到 70．1％。切胶纯化免疫马后,获得的抗SARS抗体滴度达1:2560。为亚单位疫苗研制和精制抗SARS抗体免疫制 剂提供基础。

体外冲击波能量与家兔肾脏损伤关系的研究

目的建立家兔体外冲击波致伤模型,探讨不同冲击电压和冲击次数对肾脏损伤程度的影响。方法家免30只,不同体外冲击波(14 KV·1000次、14KV·2000次、14KV·3000次、12KV·2000次和10KV·2000次)致伤,测定尿白蛋白、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶、γ-谷氨酰转移酶和IgG水平,并进行病理观察。结果体外冲击波致伤后尿白蛋白、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶和γ-谷氨酰转移酶的水平升高,而IgG的变化没有统计学意义;随冲击次数增加和冲击电压增高,尿白蛋白、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶和γ-谷氨酰转移酶的水平升高;病理观察示肾脏出现不同程度损伤。结论体外冲击波能量升高可加重肾脏损伤,建议在不影响碎石效果的前提下,应尽量降低冲击电压和减少冲击次数。