不同pH和离子强度条件下青鱼(Mylopharyngodon piceus)肌浆蛋白IgG/IgE结合能力的变化

该文以青鱼为研究对象,研究肌浆蛋白在不同p H和离子强度条件下,Ig G/Ig E结合能力及结构的变化。通过间接酶联免疫吸附测定(indirect-enzyme linked immunosorbent assay,间接ELISA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹试验测定肌浆蛋白Ig G/Ig E结合能力的变化,并结合二级结构变化、表面疏水性变化和内源荧光值变化所反映的蛋白结构改变来分析其变化机理。结果表明,p H从4. 0升高到7. 0会小幅度降低肌浆蛋白Ig G/Ig E结合能力,二级结构中α-螺旋增加而不规则卷曲减少,表面疏水性大幅减小且色氨酸疏水基向极性环境暴露。离子强度从0增加到1. 0则不会对Ig G/Ig E结合能力产生显著影响。由此可知,肌浆蛋白Ig G/Ig E结合能力变化与其构象表位有关,初步判断主要由二级结构的改变引起,但仍需要进一步研究。

生物膜干涉法检测花生蛋白与花生过敏患者血清IgE的结合能力

探索基于生物膜干涉技术对花生蛋白与花生过敏患者血清中免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)的结合能力进行检测的方法。利用链霉亲和素(streptavidin,SA)标记的传感器、生物素化的羊抗人IgE抗体、花生过敏患者血清池以及花生蛋白建立了一种测定花生蛋白与花生过敏患者血清IgE结合能力的新方法,优化检测条件为抗体1∶100稀释后线下固化20 min,血清1∶10稀释后过夜结合,完成传感器修饰。在线洗基线后用质量浓度为1 mg/mL的花生蛋白与传感器结合3 600 s,解离120 s。利用该法对不同热加工后花生蛋白与患者血清IgE的结合能力进行评估,并与常用的酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测进行比较。结果表明,本方法可以直接评估过敏原蛋白与血清IgE的结合能力,与ELISA结果相关系数达到0.91。热加工中,油炸处理提高了花生蛋白的IgE结合能力,水煮和烘烤降低了花生蛋白的IgE结合能力,且去壳热加工比带壳热加工花生的蛋白的IgE结合能力更强。

微波处理条件对蛋清结构和IgG结合能力的影响

为探究降低蛋清致敏性的新方法,在不同的微波条件下处理蛋清蛋白,通过SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳)分析分子量变化、圆二色光谱分析二级结构变化、紫外光谱分析三级结构变化、外源性荧光光谱分析疏水性变化、间接ELISA(酶联免疫吸附试验)分析IgG(免疫球蛋白G)结合能力的变化,研究微波对蛋清的影响。研究证实,微波处理降低蛋清蛋白的潜在致敏性,其中400W/30s处理后的蛋白显示出最低的IgG结合能力,所有条件下处理后的蛋清蛋白的二、三级结构均发生显著改变。80W的微波功率下,蛋白质的结构先折叠,该条件下处理30s后,蛋白结构又展开;当微波功率达到640W时,处理时间较长的蛋白分子产生堆叠。蛋白质分子的结构变化导致了其抗原性的变化。

牛乳过敏原β-乳球蛋白分离纯化方法优化及IgG结合能力分析

目的优化分离纯化方法,获得高纯度、高得率且具有良好IgG结合能力的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)。方法以超速离心脱脂、等电点沉淀、硫酸铵沉淀为前处理方法,通过Sephadex G-75凝胶柱层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析纯化β-Lg,并对纯化条件进行优化,结合十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对β-Lg进行鉴定,采用蛋白质印迹法(Western blot)对其IgG结合能力进行验证。结果凝胶层析最佳洗脱条件为0.02 mol/L pH 6.8 Tris-HCl+0.15 mol/L NaCl,流速0.4 mL/min;阴离子交换层析最佳洗脱条件为0.05 mol/L pH 6.5 Tris-HCl+0~0.5 mol/L NaCl,流速0.5 mL/min;结合SDS-PAGE与LC-MS/MS鉴定,该条件下获得的终产物为β-Lg;该方法获得的β-Lg得率为54.89%,纯度为100%(SDS-PAGE),且具有良好的IgG结合能力。结论本研究建立了一种简单、可重复的β-Lg分离纯化方法,在获得高纯度β-Lg的同时保持良好的IgG结合能力,为后续牛乳过敏及脱敏研究提供技术支撑。

过敏原表位肽与血清IgE结合能力的生物膜干涉法检测

现有血清学方法不能实现过敏原表位肽段与IgE结合能力的定量检测和实时动态观察,生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术有望弥补这一缺点。本研究选取花生过敏原Ara h 2的一个表位肽及其点突变体为检测对象,利用生物素标记的羊抗人IgE抗体偶联亲和素标记的生物传感器,特异性结合花生过敏患者血清IgE后,再监测花生过敏原表位肽及其突变体与IgE结合和解离的过程,并计算亲和力常数,评价它们的IgE结合能力。结果显示,表位肽及其突变体与花生过敏患者IgE的亲和力常数介于2.04×10-4到2.11之间。关键氨基酸的突变对亲和力常数影响较大,将过敏原表位肽中的34Q突变34N,38E突变为38D后,其IgE结合能力降低为1/2366。这说明BLI技术可以检测过敏原表位肽与IgE的结合能力,关键氨基酸分子量的减小或疏水性的增加,有望降低过敏原肽段的IgE结合能力。

不同蛋白A亲和色谱填料的制备工艺比较及性能评价

蛋白A亲和色谱填料由于能够和免疫球蛋白G(IgG)特异性作用,已广泛应用于临床医学、生物医药领域。采用不同结构和形貌的基质,通过不同的表面修饰方法得到的填料性能差别很大。研究分别以常用的琼脂糖和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)小球为基质,通过多功能环氧基定向固定蛋白A制得琼脂糖基质亲和色谱填料(A-S)和PGMA基质亲和色谱填料(P-S)。通过马来酰亚氨基定向固定蛋白A制得琼脂糖基质亲和色谱填料(A-R)和PGMA基质亲和色谱填料(P-R)。通过对蛋白A的键合工艺加以优化,研究了基质种类、基质粒径以及蛋白A含量等条件对材料性能的影响,提高了材料对IgG的吸附性能。结果表明,尽管所制备的4类材料对IgG都有一定的吸附选择性,但P-R的性能明显更加优异,可在较低的蛋白A配基密度下达到较高的动态载量。制备了不同配基密度的亲和色谱填料,其中配基密度为15.71 mg/mL的P-R对牛免疫球蛋白的动态载量为32.23 mg/mL,对人免疫球蛋白的动态载量达到54.41 mg/mL,且在碱处理160个循环后动态载量仍为初始值的94.6%。耐压测试结果表明P-R的机械强度远高于同等条件下制得的琼脂糖基质的亲和材料A-R,当流速到达80 mL/min时,PGMA基质色谱柱的流速与压力仍保持较好的线性关系,P-R的耐压性能好,可以在更高的流速下进行分离纯化。以上结果说明以马来酰亚氨基在PGMA上固定蛋白A的工艺更适宜于蛋白A亲和色谱填料的工程化生产,所发展的方法有望在固定蛋白和免疫吸附材料合成领域发挥更大的作用。

美拉德反应对菲律宾蛤仔原肌球蛋白结构及免疫活性的影响

以菲律宾蛤仔原肌球蛋白为研究对象,探讨美拉德反应导致核糖糖化后对其结构及免疫原性的影响。利用酶联免疫及点印记技术分析核糖对原肌球蛋白IgE/IgG结合能力的影响。通过圆二色谱(circular dichroism,CD)、有效赖氨酸含量测定等分析蛋白二级结构及相关基团的变化。结果表明,以美拉德反应为基础的与核糖的糖化反应时间达到12h后,产物的IgE结合能力下降76.2%,IgG结合能力下降了86.8%,α-螺旋含量下降了71.7%,蛋白表面疏水性增加了192%,有效赖氨酸含量降低了45.5%。实验表明,与核糖的糖基化反应时间达到4h后能够有效地改变菲律宾蛤仔原肌球蛋白的结构,从而降低其免疫活性。

己糖修饰的糖基化卵清蛋白产物及其致敏性分析

研究了不同己糖修饰的糖基化卵清蛋白的接枝度、表面疏水性、紫外光谱、荧光光谱及致敏性变化。结果表明:半乳糖修饰的卵清蛋白糖基化程度最高,果糖修饰的最低;糖基化反应使卵清蛋白表面疏水性降低;紫外光谱和荧光光谱构象表征表明,糖基化过程中的热处理以及分子基团的改变破坏了卵清蛋白原有构象,使芳香族氨基酸外露,且半乳糖对卵清蛋白构象的破坏程度最高;糖基化反应使卵清蛋白致敏性降低,但果糖修饰的卵清蛋白的IgG/IgE结合力下降轻微,远低于半乳糖和葡萄糖的。