用重叠PCR策略构建抑制NF-κB活性的IKBA基因突变体

目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G。方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10 000~50 000倍后作为模板,扩增突变体IKBAm,并克隆到p LVX-IRES-Zs Green载体,用双酶切及DNA测序筛选阳性质粒。结果:从HUVEC细胞克隆的IKBA基因及其突变体IKBAm基因长度均为954 bp,编码317个氨基酸,与IKBA基因相比,突变体IKBAm基因3个位点发生突变94A→G,95G→C,106T→G,编码的32/36位氨基酸由Ser突变为Ala。结论:成功克隆人IKBA基因及其32/36 Ser→Ala突变体IKBAm。

卵巢型子宫内膜异位症患者血清及内膜中IKBa的表达及其临床意义

目的探讨卵巢型子宫内膜异位症(简称内异症)患者血清及在位、异位内膜组织中IKBa的表达情况及临床意义。方法选取因卵巢型子宫内膜异位症行经腹腔镜卵巢囊肿剥除术的56例患者异位内膜组织作为研究组(异位内膜组织56份、在位内膜组织35份及血清31份),30例因其他妇科良性疾病拟行手术治疗患者的正常子宫内膜组织为对照组(内膜组织30份、血清25份),采用ELISA及免疫组化法检测两组患者血清及内膜组织中IKBa的表达,分析IKBa在内异症患者血清及组织中的表达情况,及其与临床分期、疼痛评分、卵巢囊肿直径等临床相关影响因素的关系,为术前评估提供诊断依据。结果IKBa在卵巢型子宫内膜异位症患者血清中的表达明显高于对照组;IKBa在卵巢型子宫内膜异位症异位内膜组织及在位内膜组织中的表达均明显高于正常子宫内膜组织中的表达,但在异位与在位内膜组织间IKBa的表达无明显差异;卵巢型子宫内膜异位症患者内膜组织中IKBa的表达与临床分期、有无痛经、疼痛评分、有无触痛结节、有无盆腔浸润、浸润深度、病灶单双侧分布及患者年龄均无明显相关性(P>0.05),但在卵巢异位囊肿直径≤5 cm与囊肿直径>5 cm组间及在有无子宫肌瘤等合并症组间比较有统计学意义(P<0.05),且与囊肿直径大小呈正相关。结论IKBa在卵巢型子宫内膜异位症患者血清及在位、异位内膜组织中均为高表达,且与卵巢型子宫内膜异位症异位内膜组织中的异位囊肿直径呈正相关。提示IKBa与卵巢型内异症的发生发展可能密切相关。

当归芍药散调控IKK/IκBα/NF-κB通路对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的影响

目的探究当归芍药散调控核转录因子-κB抑制蛋白激酶(IKK)/核因子κB抑制蛋白(IκBα)/核因子-κB(NF-κB)通路对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的影响。方法将48只C57BL/6J小鼠随机分为老年性聋模型组(Model组)、低剂量当归芍药散组(中药-L组,3.2 g/kg生药)、高剂量当归芍药散组(中药-H组,6.4 g/kg生药)和高剂量当归芍药散+IKK/IκBα/NF-κB信号通路激活剂白藜芦醇(RES)组(中药-H+RES组,6.4 g/kg生药+43.33 mg/kg RES),每组12只小鼠;取12只2月龄的C57BL/6J小鼠作为对照组(Control组)。采用听性脑干反应(ABR)检测各组小鼠听阈值;HE染色观察小鼠耳蜗螺旋神经节的病理变化,并对小鼠耳蜗中回与底回的螺旋神经节细胞的数量进行计数;TUNEL染色法检测小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的凋亡。ELISA法检测小鼠耳蜗组织中丙二醛(MDA)与超氧化物歧化酶(SOD)水平。qRT-PCR法检测小鼠耳蜗组织中IL-1β、IL-6与TNF-αmRNA水平。Western blot法检测小鼠耳蜗组织IKK/IκBα/NF-κB通路与凋亡相关蛋白的表达。结果Model组小鼠较Control组小鼠8 kHz、16 kHz、24 kH、32 kHz听阈值、耳蜗螺旋神经节组织TUNEL阳性细胞数、耳蜗组织MDA及IL-1β、IL-6与TNF-αmRNA水平、p-IκBα、凋亡蛋白(Bax、cleaved-Caspase-3)表达水平、IKK、NF-κB p65磷酸化水平均显著升高(均P<0.05),耳蜗螺旋神经节细胞数量、SOD水平、IκBα蛋白表达水平显著降低(均P<0.05),耳蜗螺旋神经节细胞的形态异常、排列疏松紊乱,发生空泡化,出现病理学损伤。中药-L组、中药-H组小鼠较Model组相应指标变化程度较轻(均P<0.05)。RES减弱了当归芍药散对老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡的抑制作用。结论当归芍药散可能通过下调IKK/IκBα/NF-κB通路抑制老年性聋小鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡。

百里醌抑制膀胱癌细胞生长的实验研究

目的探讨百里醌对体外膀胱癌细胞株BIU-87生长的影响及其机制。方法百里醌单独作用人膀胱癌细胞株BIU-87及预处理NF-κB激活剂TPA后百里醌再作用BIU-87细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blotting检测膀胱癌细胞质中IκBα蛋白表达。结果与对照组相比较,百里醌可显著抑制体外膀胱癌细胞株BIU-87生长,并明显诱导细胞凋亡;预处理TPA可显著削弱百里醌对BIU-87细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用;百里醌干预后膀胱癌细胞质中IκBα的表达明显上调。结论百里醌可显著抑制体外膀胱癌细胞生长,并诱导细胞凋亡,该作用可能通过促进其胞质中IκBα的表达而实现。

牛磺酸对视网膜感光细胞光损伤及NFkB/caspase-1表达的影响

目的:观察牛磺酸对光化学损伤后感光细胞凋亡的影响,并探讨其防护机制。方法:70只SD大鼠随机分为对照组(control),牛磺酸组(taurine,Tau),分别喂饲标准饲料或添加4%Tau饲料15d后接受3000±200lx持续0、1、3、6、9、12、24h光照,用TUNEL法检测感光细胞凋亡并计算凋亡指数(apoptoticindex,AI),免疫印迹法测定caspase-1和核内p65蛋白表达水平,RT-PCR法检测IκBamRNA。结果:光照9h后Tau组出现凋亡细胞,且多个时相点该组AI值显著低于对照(P<0.05);短期光照(3h/6h)诱导p65核转位,Tau组核内p65量显著高于对照组(P<0.05),长时程光照后(12h/24h)对照组核内p65显著降低,Tau组仍有较高表达;光照1h后对照组IκBamRNA迅速升高,而Tau组在光照3、6h后升高较显著。视网膜caspase-1蛋白随光照时间延长表达增高,Tau组显著低于对照组对应时相点(P<0.05)。结论:牛磺酸抑制视网膜光化学损伤中感光细胞凋亡,可能与其维持NFκB激活状态进而下调caspase-1表达有关。

芪玄益心胶囊对糖尿病大鼠胰腺IL-1β及其mRNA NF-κBp50 IκBа的影响

目的:评价芪玄益心胶囊对糖尿病(DM)大鼠的降糖作用,并探讨其作用机制。方法:以四氧嘧啶腹腔注射致胰腺损伤复制大鼠DM模型,将其随机分美吡达组、美吡达+芪玄益心胶囊高、中、低剂量组、模型组,并设空白对照组。观察各组模型血糖、糖化血清蛋白、胰腺白介素-1β(IL-1β)及其mRNA、核转录因子-κBp50(NF-κBp50)及其抑制蛋白(IκBа)水平,并与空白组对照。结果:模型组及各治疗组与空白组比较,血糖、糖化血清蛋白、IL-1β及其mRNA、NF-κBp50(细胞核)、IκBа(细胞浆)表达均显著增高(P<0.05)。美吡达+芪玄益心胶囊各剂量组与模型组比较,血糖、糖化血清蛋白、IL-1β及其mRNA、NF-κBp50、IκBа表达明显降低(P<0.05)。芪玄益心胶囊与美吡达比较,美吡达+芪玄益心胶囊高剂量组对胰腺IL-1β及其mRNA、NF-κBp50、IκBа改善优于美吡达(P<0.05)。结论:糖尿病大鼠胰腺中存在IL-1β、NF-κBp50的激活,芪玄益心胶囊对其有一定的抑制作用,推测抑制IL-1β-NF-κBp50(IκBа)这一途径的激活,是芪玄益心胶囊降低血糖,胰腺保护作用的重要机制之一。

晚期糖基化终产物激活内皮细胞核因子κB

目的探讨晚期糖基化终产物对人血管内皮细胞核因子κB的激活及作用机制。方法用晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白与人脐静脉内皮细胞株ECV304体外共同培养。用Westernblot检测核因子κB抑制蛋白水平,凝胶滞留法检测核因子κB的活性。结果晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白可致ECV304核因子κB抑制蛋白降解及核因子κB激活,并且呈时间、剂量依赖关系,抑制核因子κB抑制蛋白的降解,可抑制核因子κB的激活。结论晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白通过引起核因子κB抑制蛋白降解,导致核因子κB的激活,这一作用机制可能参与动脉粥样硬化的进程。

RelA与uPA在卵巢癌细胞系中表达的相关性研究

目的 探讨RelA对人卵巢癌细胞株A2780、OVCAR-3 uPA合成的影响。方法用RelA、IкBα反义寡核苷酸(ASODN)处理A2780、OVCAR-3细胞株,然后以Western Blot、RT—PCR检测RelA、uPA的表达以及RelA在蛋白、mRNA水平对uPA的调节作用。结果 RelA表达与uPA蛋白及mRNA表达水平均呈明显正相关。RelAASODN下调uPA的表达与其作用时间相俄。结论用RelA ASODN抑制RelA表达可明显下调uPA的表达。

肥育猪背最长肌NF-κB,IκBα和p94蛋白表达量与其剪切力的相关性研究

研究饲粮不同蛋白水平对猪骨骼肌中NF-κB、IκBα和p94蛋白表达量的影响,并探讨其与剪切力的相关性。试验选用90头约50kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪(公母各半,公猪去势),随机分为3个处理组,每个处理组3个重复,每个重复10头,分别饲喂蛋白质水平为12%、16%和20%的饲粮,各饲粮能量及氨基酸模式相同,饲养58d后屠宰取样,用蛋白质免疫印迹法测定猪背最长肌中NF-κB、IκBα和p94在骨骼肌中的蛋白含量。结果表明:饲粮蛋白水平对猪骨骼肌中NF-κB蛋白含量影响不显著(p>0.05),但对IκBα和p94蛋白含量和肌肉剪切力影响显著(p<0.05),且随着饲粮蛋白水平升高,肌肉IκBα蛋白含量呈升高趋势,p94和NF-κB蛋白含量呈降低趋势,肌肉剪切力呈升高趋势。肌肉IκBα蛋白含量与剪切力呈正相关,p94蛋白含量与剪切力呈负相关,NF-κB蛋白含量与剪切力不相关。

宝华玉兰种子提取物对NF-κB及IκBα表达的抑制作用

目的探讨宝华玉兰种子提取物对核转录因子-κB(NF-κB)、核转录因子-κB抑制蛋白α(IκBα)表达的抑制作用机制。方法使用宝华玉兰种子提取物处理人肝癌细胞HepG2后,用Western blotting法检测NF-κB及IκBα蛋白的表达变化情况。结果宝华玉兰种子提取物对IκBα的磷酸化及降解有抑制作用。宝华玉兰种子提取物可有效抑制NF-κB介导的基因转录。结论宝华玉兰种子提取物可能通过抑制IκBα磷酸化及降解,阻断NF-κB活性,进而抑制COX-2而发挥其抗炎和抗肿瘤作用。

淫羊藿总黄酮胶囊对脑卒中后认知障碍大鼠的作用

探究淫羊藿总黄酮胶囊对脑卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment,PSCI)大鼠的作用。构建大鼠大脑中动脉短暂性缺血(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型,将出现神经功能受损的大鼠随机分为模型对照组,淫羊藿总黄酮胶囊低、中、高剂量组,尼莫地平片组。给药后检测大鼠认知功能,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察脑组织病理变化,免疫荧光法检测脑组织中神经元细胞标记物(neuronal nuclei,NeuN)和星形胶质细胞标记物(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达分布情况;检测大鼠血清中β淀粉样蛋白1-42(amyloid beta 1-42,Aβ_(1-42))、神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)、多巴胺(dopamine,DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)的含量。另外,采用Western blot检测海马组织中核转录因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)、p-NF-κB、NF-κB抑制蛋白α(alpha inhibitor of NF-κB,IκBα)、p-IκBα蛋白的表达量。实验结果显示,淫羊藿总黄酮胶囊可改善模型大鼠的认知功能,其作用机制可能是通过调节p-IκBα和p-NF-κB蛋白的表达,进而抑制缺血再灌注引起的炎症反应。

芒果苷调控单核细胞NF-κB(P65)与IκBα表达对慢性支气管炎大鼠的保护作用

研究芒果苷对香烟烟熏所致慢性支气管炎大鼠外周血单核细胞NF-κB(P65)与IκBα表达的影响及其组织保护作用。以香烟烟熏建立慢性支气管炎大鼠模型。分别以实时荧光RT-PCR、流式细胞术检测单核细胞NF-κB(P65)、IκBα的mRNA与蛋白表达,ELISA法检测血清hs-CRP、TNF-α,肺组织HE染色镜检病理评分。结果显示,芒果苷显著抑制单核细胞NF-κB(P65)的mRNA与蛋白表达,上调IκBα的mRNA与蛋白表达,降低血清hs-CRP、TNF-α水平,减轻细支气管慢性炎症损伤。结果提示,芒果苷可显著减轻香烟烟熏引起的慢性细支气管炎症,此保护作用可能与其调控单核细胞NF-κB(P65)、IκBα的表达有关。

液压冲击脑损伤大鼠脑皮层I_κB_α的表达研究

目的研究大鼠液压冲击脑损伤时kB抑制蛋白α(inhibitory subunit of NF-kB,IkBα)表达变化规律。方法将60只SD大鼠随机分为两组：损伤组：48只大鼠行液压冲击打击,制作大脑损伤模型。对照组：12只大鼠仅行颅骨钻孔术。使用免疫组化及western blot分别测定大脑皮层细胞浆内IkBα的表达变化情况。免疫组化以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性结果,western blot以醋酸纤维素膜上出现棕色条带为阳性结果。结果损伤后1h,IkBα表达开始下降,12h降到最低点,损伤后24h表达开始回升,5d逐步恢复正常。结论IkBα活性变化可作为急性创伤性颅脑损伤时炎症反应程度的一项观测指标,通过抑制IkBα磷酸化降解环节,可发现一条抑制炎症反应的新途径。