表达鸡IL2和IL15重组新城疫病毒的免疫增强作用研究

为提高新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫保护效果,本研究选取鸡IL2(chIL2)和chIL15两个细胞因子作为分子佐剂,通过反向遗传操作技术分别将这两个基因克隆于NDV Clone30株中,构建表达chIL2和chIL15的重组病毒rClone30-chIL2和rClone30-ch IL15。ELISA法检测结果表明两种细胞因子在重组病毒中均能够稳定表达。将重组病毒免疫雏鸡,以NDV强毒BJ株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果。结果表明,两种重组病毒均可以诱导雏鸡产生较高水平抗体;而且两种重组病毒保护率可达100%,具有较好的保护效果。本研究为进一步提高NDV重组基因工程疫苗的效果提供了新思路。

IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建

将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的编码序列和BamHI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和NcoI/SalI双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列.

原发性胆汁性肝硬化患者外周血IL15的表达及临床意义

目的检测IL15在原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者中的表达情况,并初步探讨IL15与疾病发生发展关系。方法采用荧光定量PCR检测30例PBC、30例乙型肝炎肝硬化患者(疾病对照)和30例健康对照者的外周血单个核细胞(PBMC)中IL15 mRNA的表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中IL15蛋白水平,并分析IL15与PBC患者肝功能指标之间的相关性。结果和健康对照组相比,PBC组和疾病对照组IL15 mRNA和蛋白的表达明显升高(P<0.05);PBC患者IL15的蛋白表达水平与总胆红素(TBIL)、r-谷氨酰基转移酶(r-GT)、碱性磷酸酶(ALP)水平均呈显著正相关(r=0.599,P<0.01;r=0.407,P<0.05;r=0.452,P<0.05)。结论IL15的表达与PBC的发生发展存在一定的相关性,可能与肝内胆管损伤及其严重程度有关,可作为PBC的辅助诊断和病情监测指标之一。

重组新城疫病毒rNDV-IL15在黑色素瘤治疗中的效果

为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL15的表达量;MTT法比较rNDV-IL15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果,并比较了两者在黑色素瘤肿瘤模型中对荷瘤小鼠的治疗效果。结果表明,rNDV-IL15构建并成功拯救;病毒生长曲线表明,插入IL15后对病毒的生长无影响;IL15在细胞上清液中有较高的表达,达到(1 044.3±27.7)ng·mL-1;rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率呈时间依赖性,但两者的抑制率无显著差异;与rNDV相比,rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长。结果提示,rNDV-IL15是一种更有效的抗肿瘤制剂。

基于生物信息学分析糖尿病心肌病潜在生物标志物

目的:基于生物信息学分析糖尿病心肌病的潜在生物标志物。方法:糖尿病组及对照组小鼠心肌组织表达谱从基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)下载。应用基因本体(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析差异表达基因的功能和通路。通过基因/蛋白质相互作用检索工具(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING)和Cytoscape软件用于构建蛋白质-蛋白质相互作用网络并筛选关键差异表达基因,通过人类蛋白质谱(human protein atlas,HPA)数据库筛选差异表达且在血液中可通过免疫法检测的细胞外蛋白基因。结果:共筛选出857个差异表达基因,主要富集的细胞过程为小鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)酶介导的信号调节、大鼠肉瘤蛋白(Rat Sarcoma,Ras)信号调节、蛋白质乙酰化。最终筛选出7个差异表达基因:CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,Cxcl10)、间质表皮转化因子(mesenchymal to epithelial transition factor,Met)、巨噬细胞集落刺激因子受体(feline mcDonough sarcoma receptor,Fms)样酪氨酸激酶1(FMS-like tyrosine kinase 1,Flt1)、促红细胞生成素(erythropoietin,Epo)、白细胞介素15(interleukin-15,Il15)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tfrc)、β2微球蛋白(beta-2 Microglobulin,B2m),编码可在血液中通过免疫法检测的细胞外蛋白。结论:Cxcl10、Met、Flt1、Epo、Il15、Tfrc、B2m或许可作为糖尿病心肌病筛查的潜在的生物标志物。

IL15通过Rac1发挥抑制结直肠癌EMT的生物信息学分析及分子机制研究

目的基于生物信息学分析,探讨结直肠癌的转移机制并为其提供潜在的治疗靶点。方法从GEO数据库下载Ⅰ~Ⅲ期结直肠癌淋巴结转移的转录组测序表达谱数据并进行差异表达分析,通过Cytoscape、Funrich等软件对结直肠癌转移相关基因进行筛选。采用Western blot法检测结直肠癌细胞中IL15、Rac1、E-Cadherin、N-Cadherin、Slug和Vimentin的表达,采用细胞划痕实验及Transwell实验检测IL15沉默对SW620和LoVo细胞系迁移和侵袭的影响。结果通过极大系中心系数算法、GO和KEGG富集等生物信息学分析手段,设定不同的P值作为限定条件,建立3个基因子集,通过筛选及KEGG和PPI分析,发现NK细胞介导的细胞毒反应与结直肠癌关系密切,其中IL15被显著富集并显示与结直肠癌相关蛋白具有显著相关性(P<0.05)。抑制IL15导致Rac1及EMT相关蛋白表达发生上调,通过细胞划痕实验及Transwell实验发现,抑制IL15能够促进SW620和LoVo细胞的迁移和侵袭。结论IL15沉默促进了结直肠癌细胞系的EMT进程,IL15是结直肠癌转移的抑制因子。

pVR-IL15基因佐剂对表达HBsAg重组病毒免疫效果的影响

目的 探索pVR-IL15基因佐剂在表达HBsAg病毒治疗型疫苗的不同免疫策略中对免疫应答的影响.方法 采用了携带乙肝病毒S基因片段的DNA、重组Ankara痘病毒和重组腺病毒序贯免疫策略免疫BALB/c小鼠,在序贯免疫策略的基础上联合pVR-IL15免疫.用ELISA和IFN-γELISPOT方法检测不同免疫组别中小鼠的细胞免疫和体液免疫反应强度.结果 联合pVR-IL15免疫组的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平均显著高于无联合pVR-IL15免疫组,差异具有统计学意义.结论 pVR-IL15基因佐剂能够增强表达HBsAg重组病毒诱导的小鼠免疫应答.

IL-15对MDS患者CD34^+细胞诱导增殖分化和抗凋亡作用

为了研究IL-15对体外培养的MDSCD34+细胞诱导增殖分化及凋亡的抑制作用,应用MACS免疫磁珠分离系统分离高富集度MDSCD34+细胞,建立以造血生长因子为基础的体外培养体系,用不同浓度的IL-15作用于MDSCD34+细胞,采用流式细胞术检测和免疫细胞化学染色等方法观察培养后的细胞表面抗原表达、细胞周期、凋亡指数及细胞形态的变化情况,并进行了定量分析。结果表明,MDSCD34+细胞经IL-15作用后,MDSCD34+细胞出现明显增殖和分化,细胞周期变异,增殖指数和细胞计数增加,形态学向成熟转化,实验组各表面抗原水平CD71、CD33和CD19均较对照组为高,细胞凋亡率则较对照组下降。结论IL-15对MDSCD34+细胞有一定的诱导增殖分化和抗凋亡作用,在MDS治疗方面可能有一定的应用前景。

乙型肝炎慢加急性肝衰竭患者血清白细胞介素-15、-17检测及意义

由乙型肝炎病毒（HBV）导致的慢加急性肝衰竭（ACLF）是我国传染病死亡的重要原因之一,目前其发生机制尚不明确。有学者提出的“三重打击（免疫损伤、缺血缺氧性损伤及内毒素血症）”学说和“免疫麻痹”学说,对细胞因子在ACLF中所起的作用进行了解释〔1〕。白细胞介素（IL）-15与IL-17在慢性乙型肝炎（CHB）的表达已有学者做了研究,

小鼠白细胞介素-15与其受体α亚单位协同作用的初步研究

目的原核表达小鼠白细胞介素-15（mouse interleukin 15，mlL-15），并初步研究其与受体α亚单位（mlL-15R α）的协同效应。方法从小鼠肾脏组织克隆mlL-15成熟从部分的基因片段，并亚克隆至原核表达载体pQE-30，所得重组表达质粒pQE-30/mlL-15转化EcoliM15。得到的转化子经IPTG诱导后获得重组表达产物，并进行SDS-PAGE和Western Blot检测。Ni-NTA亲和层析柱上纯化、复性重组蛋白，以获得成熟的mlL-15。采用MTT法检测重组mIL-15促CTLL-2细胞增殖的生物学活性，并进一步研究，mlL-15与mlL-15Rd结合后协同促进靶细胞增殖的功能。结果重组mlL-15丰要以包涵体形式存在，其相对分子质最约为14ku，并能为抗His和抗mlL-15抗体昕特异性识别。经Ni-NTA柱上蛋白纯化、包涵体复性后，可得到纯度约为95％的成熟蛋白。成熟mlL-15能够促进CTLL-2细胞增殖，并具有明显的屋效关系；并且，在mIL-15Rα的配合下，mlL-15的促CTLL-2细胞增殖的活性冠著增强，尤其足在低mIL-15浓度条件下该协同作用表现得愈发明显。结论获得了具有牛物活性重组mlL-15，并初步研究了其与mlL-15Ra组成复合物的体外协同效应。该研究成果为进一步研究lL-15及IL-15Rd协同性的作用机理和开展小鼠成体免疫治疗研究奠定了基础。

CD16单抗联合细胞因子体外扩增的NK细胞对K562杀伤功能研究

目的:建立CD16单抗联合细胞因子IL2、IL15、IL18体外扩增NK细胞的方法,并用扩增后的细胞杀伤K562细胞,研究其杀伤功能,确定一种高效的NK细胞体外培养方案。方法:抽取5例健康志愿者外周血,Ficoll分离单个核细胞,分组培养,分别为IL2+IL15组、IL2+IL15+IL18组、IL2+IL15+IL18+CD16单抗免疫包被组。按这三种方案分组培养,分别在第6、9、12、15、18天和21天计算总细胞扩增倍数,流式细胞检测NK细胞的表型,利用各种方案扩增后的NK细胞作为效应细胞,与K562细胞按不同靶效比进行体外杀伤实验,分析各种方案培养的NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:IL2+IL15+IL18+CD16单抗免疫包被组的扩增倍数和阳性率均高于IL2+IL15组、IL2+IL15+IL18组,P<0.05;而IL2+IL15组、IL2+IL15+IL18组之间在扩增倍数和阳性率上均无显著差异(P>0.05)。杀伤实验显示,在不同效靶比情况下IL2+IL15+IL18+CD16单抗免疫包被组均比其他两组有更强的杀伤活性。而且随着效靶比的增加,NK细胞的杀伤更强。结论:CD16单抗联合IL2、IL15、IL18、可明显促进NK的扩增能力,并提高体外扩增后对K562细胞的杀伤活性。

IL-15基因佐剂对HIV-1B亚型gp160DNA及腺病毒载体疫苗的免疫效果的影响

本研究构建了IL15质粒以评估其对表达HIV-1gp160的DNA和腺病毒5型载体疫苗的免疫效果的影响。我们构建表达IL15的质粒pVR-IL15,将pVR-IL15联合pVR-HIVgp160初免Ad5-HIVgp160加强方式免疫BALB/c小鼠,用IFN-γELISPOT和ELISA等方法比较疫苗单独免疫组小鼠与疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫和体液免疫反应的强度。结果显示疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫反应和体液免疫反应比疫苗单独免疫组小鼠相均有显著增强。构建的IL15基因佐剂可以增强HIV DNA疫苗初免和腺病毒疫苗加强免疫策略的免疫效果。

四君子汤调节NKG2A表达影响NK细胞抗结肠癌作用

目的:探讨中药复方四君子汤通过调节NKG2A的表达影响自然杀伤(NK)细胞抗结肠癌的作用。方法:分离、纯化来自健康人外周血NK细胞进行培养,分别构建人NK细胞单培、HCT116细胞单培和NK细胞与HCT116细胞共培模型,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测NK细胞中自然杀伤细胞2族成员A(NKG2A)、白细胞介素(IL)-15及结肠癌细胞中组织相容性白细胞抗原E(HLA-E)mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NK细胞中IL-15分泌;噻唑蓝(MTT)比色法筛选IL-15的浓度,检测四君子汤和IL-15对NK细胞活性和共培模型中HCT116细胞活性的影响,Real-time PCR检测四君子汤和IL-15对NK细胞中NKG2A和HCT116中HLA-E mRNA表达的影响;使用Anti-NKG2A抗体(M)阻断NKG2A/HLA-E通路,MTT比色法检测共培模型中HCT116细胞增殖情况。结果:与单培组比较,NK细胞和HCT116细胞相互作用引起NK细胞的NKG2A和HCT116中的HLA-E mRNA表达均上调(P<0.05);IL-15 mRNA表达和分泌也增加(P<0.05);IL-15可增强NK细胞活性和抗结肠癌作用(P<0.01),也可上调NKG2A表达(P<0.05);与空白组比较,四君子汤组、四君子汤+IL-15组的NK细胞活性和抗结肠癌作用进一步增加(P<0.01),Real-time PCR结果显示,与空白组比较,四君子汤组和四君子汤+IL-15组中NK细胞NKG2A表达下调(P<0.05),共培模型中四君子汤组HCT116中HLA-E表达下调(P<0.01);与相应未加M组比较,M组与IL-15+M组HCT116细胞增殖被抑制(P<0.01)。结论:NK细胞与结肠癌细胞相互作用可引起NKG2A-HLAE通路活化导致NK功能受损,四君子汤可抑制该信号激活从而恢复NK细胞抗结肠癌作用。