基于纳米孔靶向全基因测序技术的新冠肺炎病例快速鉴定研究

目的探索快速识别新型冠状病毒的方法,为新冠肺炎防控提供技术支撑。方法分别运用基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)靶向全基因组测序技术对1例境外输入新冠肺炎确诊病例进行基因组测序。使用artic-ncov2019软件、CLC Genomics Workbench(Version 21.0)软件和DNAstar软件等进行数据处理和分析。结果基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5分别在7 h和30 h左右获得SARS-CoV-2全基因组数据,分别为29848bp和29801bp,两者共同29801bp数据部分同源性100%,经分析为新冠病毒B.1.1.7变异株。结论在对该病例样本的全基因测序中,基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C的SARS-CoV-2靶向全基因组测序技术将检测周期缩短至7 h左右,能够实现快速、准确地对SARS-CoV-2进行实时测序。

基于Illumina MiSeq高通量测序的燕麦种带细菌多样性及功能分析

采用高通量测序法,分析7份来自不同地区的燕麦种带细菌群落的细菌丰度、Alpha多样性、Beta多样性和物种组成差异,并采用PICRUSt和FAPROTAX功能预测的方法分析了各种带细菌间的丰度差异。结果显示:1)7份燕麦中共获得5187个细菌可操作分类单元(OTUs),主要归属于33个门、180个目和435个属。2)基于OTUs的丰度及注释信息,7份燕麦种带细菌群落中变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、放线菌门和蓝菌门为优势菌门,立克次氏体目和鞘脂单胞菌目为优势菌目,鞘氨醇单胞菌属、Solibacter和假节杆菌属为优势菌属。3) Alpha多样性和Beta多样性表明不同燕麦品种的细菌群落多样性和群落结构具有较大差异,其中LXY-5具有最大的Alpha多样性。LEFSe分析更进一步显示不同的燕麦品种生物标记的物种不同。4) PICRUSt和FAPROTAX功能预测分析表明,燕麦种带细菌群落主要有代谢、有机系统和人类疾病3个代谢通路,分属于有42个KEGG和24个COG的二级代谢途径;FAPROTAX功能注释后共获得52个生态功能。研究结果为明确燕麦种带细菌多样性及开发新型基因资源提供了理论依据。

用于Illumina测序平台不同试剂盒制备RNA-seq文库的方法比较

RNA-seq是利用深度测序进行转录组分析的技术,并且在新一代测序的主流平台Illumina上运用广泛。针对Illumina平台的RNA-Seq建库,目前有多个不同类型的建库方法支持该技术,但是在操作步骤和成本上有很大差距。本研究分别试验了Tru Seq RNA文库制备、NEBNext RNA文库制备以及KAPA RNA文库制备3种方法,首次系统地对这3种建库方法得到的片段长度,浓度和建库流程进行了比较分析。研究显示,3种文库的片段长度都集中在300~1 000 bp之间,KAPA RNA文库制备得到的文库浓度最高,该制备方法只需要进行一次磁珠纯化,操作简便,成本低,所需要的起始量低,适用于进行大规模的建库实验。

利用Illumina MiSeq测序平台分析沐川乌骨黑鸡空肠微生物多样性

为探索沐川乌骨鸡肠道微生物多样性,采用Illumina MiSeq测序平台对10羽沐川乌骨鸡的空肠内容物样本中微生物的16S rDNA-V4变异区进行测序,利用UPARSE等软件分析和统计样品中的操作分类单元(OTUs)数量,并进行物种注释及丰度分析,揭示样品的物种构成。结果表明,共获得667466条tags,在97%相似水平上进行OTU分类,被归类于3154个OTUs,且由稀释曲线可知此次测序结果较全面地覆盖了沐川乌骨黑鸡空肠微生物群落。门水平上,占优势的门主要有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria),但这3种优势菌门在不同样品中所占比例均有所差异。在属水平上,在10个样品中所占比例均大于1%的菌属有乳杆菌属(Lactobacillus)和Romboutsia菌属。

基于Illumina PE300高通量测序的海南糟粕醋微生物多样性分析

目的研究海南糟粕醋中微生物的多样性,分析海南糟粕醋在自然条件下贮藏时的优势菌及风险菌。方法采用Illumina PE300高通量测序技术对海南糟粕醋中细菌和真菌群落进行多样性分析,扩增糟粕醋中细菌的16S rDNA和真菌的ITS序列。结果细菌多样性测序获得306,600条序列,130,745,424碱基(base pair,bp),505操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),可归属为23门(phylum)、51纲(class)、115目(order)、191科(family)、312属(genus)、432种(species);真菌多样性测序获得612,015条序列,132,784,567 bp,27 OTU,可归属为3 phylum、7 class、12 order、18 family、24 genus、25 species。糟粕醋在自然条件下贮藏时,主要细菌属为:乳酸菌属(Lactobacillus)、棒杆菌属(Corynebacteriums)、乳酪短杆菌属(Brevibacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus);主要真菌属为:哈萨克斯坦酵母(Kazachstania)、伊萨酵母属(Issatchenkia)。未经灭菌的糟粕醋可能存在的风险菌为:炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、布鲁氏菌(Brucella)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)。结论在糟粕醋中细菌的组成更为复杂,但真菌对糟粕醋品质的影响较大,本研究获得糟粕醋在自然放置条件下微生物菌群的变化,为糟粕醋的贮藏提供理论支持。

利用Illumina MiSeq测序平台分析健康与腹泻食蟹猴粪样菌群

本试验通过对比健康与腹泻食蟹猴粪便菌群的差异,初步探讨腹泻对食蟹猴粪便菌群的影响。采集成年腹泻与健康食蟹猴粪样各6份,用细菌16Sr DNA通用引物扩增V3—V4 区,采用Illumina MiSeq测序平台对食蟹猴粪便微生物进行研究。结果表明,Alpha多样性指数分析,健康组与腹泻组的微生物多样性指数( Shannon、Simpson )差异不显著,群落丰富度指数( Chao、Ace )差异显著。PCA主成分分析,健康组与腹泻组粪便菌群具有明显的差异。通过对健康组与腹泻组物种菌群组成分析,运用MetaStat方法分析,与健康组相比,腹泻组的芽孢杆菌纲、乳酸杆菌目、乳酸杆菌属含量显著降低( P <0.05 ),腹泻组 Subdoligranulum 属显著升高( P <0.05 )。LEfSe ( LDA Effect Size )分析( LDA阈值为1 ),乳杆菌目,芽孢杆菌纲,乳杆菌科,乳酸杆菌属在健康组中显著富集,弯曲杆菌科,弯曲杆菌属在腹泻组显著富集。与健康食蟹猴相比,腹泻食蟹猴微生物区系中的一些菌群发生变化,菌群结构有差异但不显著( P >0.05 ),腹泻食蟹猴菌群结构有简单化的趋势。

基于Illumina平台mNGS技术在老年社区获得性肺炎肺泡灌洗液病原学诊断中的应用

目的 探讨基于Illumina平台宏基因组二代测序(mNGS)技术在老年社区获得性肺炎(CAP)肺泡灌洗液病原学检查中的应用。方法 选取2022年1月至2022年6月内江第一人民医院收治的疑诊老年CAP患者200例为研究对象,比较肺泡灌洗液mNGS病原体检测与传统细菌培养鉴定法对老年CAP的诊断价值。结果 200例患者经病原学检查共检出阳性154例(77.00%),其中细菌感染119例(59.50%)、病毒感染59例(29.50%)、真菌感染30例(15.00%)、肺炎支原体感染11例(5.50%)、肺炎衣原体感染7例(3.50%),包含混合感染50例(25.00%);mNGS共检出阳性183例(91.5%),其中细菌感染127例(63.50%)、病毒感染96例(48.00%)、真菌感染37例(18.50%)、肺炎支原体感染29例(14.50%)、肺炎衣原体感染15例(750%),包含混合感染75例(37.50%);mNGS阳性检出率、混合感染检测率较传统细菌培养高,差异有统计学意义(χ^(2)=15.845、7.723,P<0.05);mNGS检测时间较传统细菌培养鉴定短,差异有统计学意义(t=86.888,P<0.05);以临床诊断为金标准,mNGS诊断老年CAP的灵敏度、特异度为97.31%、85.71%,传统细菌培养灵敏度、特异度为71.43%、80.64%。结论 基于Illumina平台mNGS对病原体具有较高的检出率,检测时间更短,检测灵敏度、特异度更好,可以为老年CAP临床诊断提供重要依据。

Illumina MiSeq高通量测序分析核桃内生细菌多样性

应用Illumina Mi Seq高通量测序技术测定核桃内生细菌的16S r DNA-V4变异区序列,使用Uparse等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析内生细菌的丰度和α-多样性。获得了用于分析的有效序列63 183条,OTU数为103。稀释曲线表明测序深度充分,OTU数量接近于饱和。核桃样品的Chao1指数为105.143,Shannon多样性指数为1.823。核桃内生细菌主要分布于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,27.27%)、盐单胞菌属(Halomonas,27.27%)、土壤杆菌属(Agrobacterium,45.45%),这3个属是核桃内生细菌优势菌属。

Illumina测序16S rRNA标签法分析细菌性阴道病患者阴道菌群多样性

目的从菌群总体角度分析和比较健康育龄期女性和细菌性阴道病(BV)患者阴道菌群差异。方法采集临床Amsel标准及Nugent评分筛选的37例BV患者及37例健康育龄期女性阴道穹窿分泌物标本,提取总基因组DNA,对16S rRNA V6区基因进行扩增,所有扩增的PCR产物经IIlumina测序后,通过BIPES、UCHIME、TSC、GAST最终得到样品的物种信息。结果健康育龄期女性阴道分泌物乳酸杆菌占95%以上,单独以惰性乳酸杆菌或卷曲乳酸杆菌为主,或者两者比例相当,同时存在少量加德纳氏菌属,颗粒链球菌属,链球菌属,普氏菌菌属,埃希氏杆菌属和其它菌属;30例BV患者阴道菌群Alpha多样性明显增加(P<0.001),Beta多样性也发生了明显变化,表现为乳酸杆菌明显减少,其相对比例从45%到1%(24例),以惰性乳酸杆菌为主,部分患者(6例)甚至未检出,同时加德纳氏菌属,普氏菌菌属,颗粒链球菌属,厌氧球菌,微单胞菌属,Peptoniphilus.harei-消化链球菌属,戴阿李斯特杆菌属等相对丰富度增加,不同于既往研究的是7例BV患者以少见的格氏乳杆菌,嗜酸乳杆菌为优势菌群,约占75%～50%。结论健康育龄女性阴道菌群以乳酸杆菌占绝对优势,单独以惰性乳酸杆菌或卷曲乳酸杆菌为主,或者两者相当,并与多种微生物并存;大部分BV患者阴道菌群表现为乳酸杆菌显著减少甚至缺失,小部分BV患者以少见的格氏乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌为优势菌群。

基于Illumina高通量测序的泡桐转录组研究

利用新一代高通量测序技术平台Illumina Solexa对泡桐进行转录组测序和数据denovo组装,并对得到的unigene进行功能注释、分类及代谢通路分析。结果表明,N50值为2278bp、平均长度为1410bp的泡桐unigene共有188019条,将其与NCBI的Nr和Swiss-Prot数据库比对后发现,分别有120808条和85880条unigene与其他物种的基因具有同源性。利用COG数据库可将有关的41914条泡桐unigene分成25类,KEGG数据库分析发现共有43553个unigene参与215种代谢通路。找到与木质素合成相关的泡桐unigene。

采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性

本试验旨在采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性。选取30窝同日出生、胎次相同和平均窝重相近的健康新生仔兔,于14日龄开始补饲,断奶当日(30日龄)从30窝仔兔中选取48只体重相近的健康幼兔作为试验兔,饲喂不添加抗生素的基础饲粮。分别于断奶当日及断奶后1、2和3周随机选取6只健康幼兔屠宰,无菌采集盲肠内容物,从中选取3个样本提取微生物基因组总DNA,采用Illumina MiSeq测序技术检测其中的微生物群落多样性。结果显示:1)健康幼兔盲肠微生物群落α多样性指数指标(ACE值、Chao1值、Shannnon值)随日龄的增长有升高的趋势(P<0.10)。2)不同日龄健康幼兔盲肠微生物各菌门的相对丰度差异不显著(P>0.05),且均主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门组成;在科水平上,厚壁菌门主要由瘤胃球菌科和毛螺旋菌科组成,拟杆菌门主要由拟杆菌科和紫单胞菌科组成;在属水平上,拟杆菌属、Barnesiella、Akkermansia、普雷沃氏菌属和4种未知菌属为优势菌属;拟杆菌属和Parabacteroides在断奶当天的相对丰度较高,且与其他日龄组差异显著(P<0.05)。3)健康幼兔盲肠中均存在乳杆菌属,且相对丰度在各日龄组间差异不显著(P>0.05)。由此得出,断奶时健康幼兔盲肠微生物区系已基本建立,相对丰度最大的优势菌属为拟杆菌属,但断奶后随着日龄的增长,微生物组成趋于复杂。

Illumina测序技术在母血检测胎儿非整倍体中应用

目的研究Illumina测序技术在母血中检测胎儿非整倍体的可行性,及其在无创性产前诊断中的应用前景。方法 68例孕12-39周具有产前诊断指征的单胎妊娠孕妇抽取外周血进行离心、提取血浆中游离DNA,运用Illumina Hiseq2000测序技术进行DNA测序及统计分析。结果 68例孕妇通过Illumina测序技术检测出3例21三体,2例18三体、1例13三体及1例47,XYY。因为濒死胎儿羊水脱落细胞活力极低而致羊水培养失败,传统型染色体核型分析未检测出1例21三体。结论 Illumina测序作为一种无创性产前诊断技术,可准确地筛查21、18、13、X、Y等染色体非整倍体异常,具有安全、准确率高及假阳性率低的优点,值得临床推广。

纳米孔测序技术在DNA信息存储领域的应用

脱氧核糖核酸(DNA)存储是一种以人工合成的生物大分子DNA作为信息载体的新型存储技术,具有存储密度高、存储量大、存储时间长、损耗率低等优点,有望成为一种新的数据存储介质。随着DNA合成技术(数据写入)和DNA测序技术(数据读取)的快速发展,DNA存储已成为下一代存储技术的热点。然而目前通过二代测序技术实现DNA数据的读取仍然是一个操作复杂、耗时长且成本较高的过程。如何更深入融合和改进DNA合成技术和测序技术,将DNA信息的存储和读取进一步快速高效地实现,是目前需要解决的问题。本研究设计并实践了基于便携式的国产纳米孔测序平台开展DNA存储信息快速读取的可能性,实现了4 h内将存储于DNA片段中一首中文诗词进行重新测序和即时解码,验证了国产纳米孔测序技术从存储DNA信息的介质中即时读取信息的能力。

Illumina MiSeq高通量测序降解黑龙江绥化地区玉米秸秆细菌菌群的研究

以研究黑龙江绥化地区农产废弃物玉米秸秆细菌降解菌群为目的,采用Illumina MiSeq微生物多样性测序的方法,对2015～2017年玉米秸秆的菌群多样性进行测序。采用生物信息学的方法对低温自然降解秸秆细菌群落中主要降解菌进行分析,并筛选了2015～2017年玉米秸秆中两株丰度最高的纤维素降解细菌,经多次分离纯化并结合刚果红染色法验证其低温降解纤维素的功能。结果表明,测序获得61564385 bp,质控后共141219条16S rDNA序列,Silva数据库比对到14门、29纲、70目、136科、282属。其中假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、德沃西亚菌属(Devosia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)和链霉菌属(Streptomyces)等是降解秸秆的主要细菌菌株,即该地区玉米秸秆细菌菌群多样性丰富,且研究筛选出的两株细菌具有纤维素降解能力。

采用Illumina测序技术检测非小细胞肺癌驱动基因关键位点突变

肺癌尤其是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers,NSCLC)是许多国家常见且病死率位于首位的恶性肿瘤[1]。目前认为NSCLC是由一系列驱动基因突变形成的恶性肿瘤,包括EGFR、ALK、KRAS、NRAS、BRAF、HER-2、ROS1、RET、MET和PIK3CA等基因。现阶段手术、化疗、放疗等治疗手段效果均不理想[2],针对以上10个基因突变的分子靶向治疗的出现给患者带来了新曙光,但前提是必须有精确的分子学信息,这就要求有合适的分子检测方法。Illumina测序技术已应用于多种常见肿瘤基因的检测,如乳腺癌、胰腺癌等。本文现介绍采用Illumina测序技术在检测和分析NSCLC以上10个驱动基因关键位点突变的应用。

基于Illumina MiSeq高通量测序技术解析利川酱豆真菌多样性

该研究利用Illumina MiSeq高通量测序技术对湖北省恩施土家族苗族自治州利川市酱豆样品的真菌多样性和群落结构进行解析。结果表明,利川酱豆样品中的真菌菌群隶属于3个门、15个纲、27个目、34个科、45个属,核心真菌门为子囊菌门(Ascomycota)(96.79%)和担子菌门(Basidiomycota)(2.63%);核心真菌属为毕赤酵母属(Pichia)(37.46%)、曲霉属(Aspergillus)(29.48%)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)(3.92%)、假丝酵母属(Candida)(2.86%)、Starmerella(2.62%)、节担菌属(Wallemia)(2.19%)和镰刀菌属(Fusarium)(1.03%),且核心真菌之间的相关性均不显著(P>0.05)。

应用Illumina Miseq测序技术分析传统酸马奶细菌多样性

利用Illumina Miseq高通量测序并结合数理统计对传统酸马奶的细菌多样性进行分析。结果表明,其优势细菌门为厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria),两者相对丰度之和可达98%;在属水平检出78个细菌属,其主要为乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus),两者相对丰度可达70%~82%。此外,发现牧民手工酿造酸马奶样品的细菌多样性要显著高于农场生产样品,且两者的细菌群落结构存在明显差异。该研究全面了解传统酸马奶的细菌种群分布,为工业化生产提供理论依据及筛选潜在价值的益生菌提供数据参考。

基于Illumina高通量测序的马来熊(Helarctos malayanus)粪便菌群多样性初探

应用新一代高通量测序技术Illumina Miseq对上海动物园3只马来熊的12个粪便样本中的菌群结构及其多样性进行检测和分析。样中共检测到884 522条序列,共检测到15个菌门,主要有7个优势菌门,按照多样性高低依次是:厚壁菌门(Firmicutes)(54.70%)、变形菌门(Proteobacteria)(41.90%)、梭杆菌门(Fusobacteria)(1.80%)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)(0.70%)、放线菌门(Actinobacteria)(0.20%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和未定门(TM7)。粪便样本中能够确定到菌属的序列占73.10%,以链球菌属(Streptococcus),大肠杆菌/志贺菌属(Escherichia-Shigella)和梭状杆菌属(Clostridium)为优势菌属。3只马来熊粪便菌群多样性比较:LS02粪便菌群多样性最高,其次是LS01,和LS03。结论:马来熊粪便菌群存在个体差异,但同一个体的优势菌群组成非常相似,年龄和性别可能会对马来熊粪便菌群产生影响。

基于高通量RNA测序数据分析的弹性云平台

高通量RNA测序(RNA-seq)技术为研究人员提供了海量数据,如何对这些数据进行快速有效的分析,并为后续转录组、基因表达等研究提供支持,是生物信息学领域的热点方向。本文讨论了当前RNA-seq数据分析的发展水平和常用软件、算法,并设计了一系列数据处理模块和分析流程。同时,为了给用户提供更好的使用环境,我们设计了基于弹性资源管理系统的生物云平台BioCloud。该平台集成了丰富的软件,采用高灵活度、高扩展性的体系架构,在给用户提供低成本、高性能计算服务的同时,还提供个性化的流程定制服务。

基于illumina测序技术的IGROV-1/CP细胞中miRNA种类鉴定及相对丰度分析

从正常培养的IGROV-1/CP细胞中提取小RNA,构建小RNA的cDNA文库,然后用illum ina通用测序平台对上述cDNA文库进行测序。从测序获得的序列数据中去除冗余数据后,与已知人类m iRNA序列数据库进行比对,获得IGROV-1/CP细胞m iRNA表达谱。以所获的序列长度与已知人类m iRNA数据库中序列长度差异不大于2和无碱基错配为限制条件,共找到53种已知m iRNA。按在cDNA文库测序中的出现频率计算,出现频率不大于10的低拷贝m iRNA最多,占检测到所有m iRNA种类的56.6%。说明illum ina通用测序技术能够在检测细胞内的各种小RNA序列的同时反应相对丰度信息,该研究利用上述新技术获得了顺铂耐药性IGROV-1/CP细胞系m iRNA表达种类和相对丰度的实验数据。