海南斑等蝎钾通道阻断剂Im58的克隆、表达、纯化和鉴定

为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥PCR引物,通过overlap PCR的方法扩增出蝎毒肽Im58DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌E.coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经IPTG诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由MALDI-TOF-MS来精确测定重组多肽的分子量.结果表明:Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.