基于立即早期蛋白IE62建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法

目的:基于水痘-带状疱疹病毒(VZV)立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术(ELISpot)建立一种新型的VZV感染性滴度的快速检测方法。方法:应用生物信息学方法设计并合成VZV-IE62蛋白的多肽抗原,牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,筛选和制备抗VZV-IE62单克隆抗体,应用Western blot和免疫荧光法等开展抗体性能评价,继而应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大法建立新型的VZV感染性滴度检测方法,并与经典空斑计数法进行比较。结果:获得抗VZV-IE62的单克隆抗体1B7,应用于ELISpot方法可特异识别VZV感染后的细胞,以之为基础建立了新型的VZV感染性滴度检测方法。相比经典空斑计数法,该方法可显著缩短检测时间(从5至7 d缩短至32 h)检测结果具有较好的一致性。结论:本研究建立了一种新型的基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法(VZV-IE62 ELISpot),具有潜在的转化应用前景,可为VZV的防治研究提供支持。

国产水痘减毒活疫苗株即刻早期基因ORF62的特征

目的：通过比较国产水痘减毒活疫苗株（ vOka ）与其父系株（ pOka ）即刻早期基因（ IE） ORF62启动子区序列及其启动活力、编码区序列及其反式激活力差别，探讨vOka株ORF62突变在其减毒机制中的可能作用。方法分别构建pOka株、长春百克生物科技股份公司vOka-BK株、上海生物制品研究所vOka-SH株和葛兰素史克公司vOka-GSK株（对照） ORF62启动子-报告子质粒和ORF62编码区表达质粒，通过测序分析ORF62启动子区和编码区序列差异，再应用基因转染瞬时表达技术分析3株vOka与pOka株ORF62启动子活力及ORF62编码IE62对即刻早期基因ORF4、早期基因ORF28和晚期基因ORF67启动子的反式激活力差异。结果与pOka株比较，3株vOka 一致存在ORF62启动子区110050位点T缺失突变，该突变未导致启动子区的转录因子结合基序改变，但3株vOka ORF62启动子的启动活力显著低于pOka株；3株vOka ORF62编码区存在一致的碱基置换突变并分别产生SmaⅠ、NaeⅠ和BssHⅡ新酶切位点；除vOka-SH株IE62在CV-1细胞中对ORF4启动子的反式激活力显著低于pOka株外，3株vOka IE62在CV-1和MeWo细胞中对ORF4、ORF28、ORF67启动子的反式激活力均显著高于pOka株。结论3株vOka ORF62启动子区110050位点T缺失突变可能是启动子活力降低和IE62反式激活力改变的原因之一，vOka与pOka株ORF62启动子活力和IE62反式激活力差异与转染细胞类型关系不大。

白黎芦醇体外抑制水痘-带状疱疹病毒作用机制的研究

目的应用构建的水痘-带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MV9G进一步研究白黎芦醇体外抑制VZV的作用机制。方法将无细胞VZV直接感染MV9G细胞（CFVs直接感染）或将带细胞VZV与MV9G细胞共培养（CAVs共培养）以激发MV9G细胞表达报告基因萤火虫荧光素酶。在CFVs直接感染前或CAVs共培养不同时间点加入白黎芦醇，通过比较药物对CFVs或CAVs激发荧光素酶的抑制强度分析白黎芦醇直接灭活病毒、抑制病毒黏附和穿透、抑制病毒在细胞内复制及其时间点和可逆性；通过比较药物作用前后VZV即刻早期蛋白62（IE62）mRNA拷贝数和IE62表达强度变化分析白黎芦醇对IE62转录和表达的抑制作用。结果白黎芦醇〉30．0μg／ml时MV9G细胞三磷酸腺苷（ATPs）含量随药物浓度升高而逐渐降低，ATPs降低50％时白黎芦醇浓度（CD50）约60．3μg/ml。CFVs与白黎芦醇（25．0μg/ml）预混37℃水浴孵育2h后直接感染MV9G细胞，CFVs激发荧光素酶下降50％。MV9G细胞在含白黎芦醇培养基中37％孵育2h后直接感染CFVs，CFVs激发荧光素酶随药物浓度升高而逐渐降低，但4℃孵育时无显著变化。在CAVs共培养中加入白黎芦醇后CAVs激发荧光素酶显著降低，药物抑制荧光素酶50％时浓度（IC50）约8．7μg/ml。分别在CAVs共培养3、6、9、12、24、30和36h时加入白黎芦醇，3～24h加药各组CAVs激发荧光素酶均显著高于对照组，但1h、30h和36h加药组与对照组问差异无统计学意义。CAVs共培养时撤除白黎芦醇后CAVs激发荧光素酶显著高于撤药前，尤以24h和72h撤药组明显。VZVIE62mRNA拷贝数和IE62抗体阳性细胞数随药物作用时间延长而逐渐降低。结论白黎芦醇细胞毒性较强，MV9G细胞可耐受最高浓度为30．0μg／ml。白黎芦醇部分灭活CFVs、抑制CFVs穿透MV9G细胞但对CFVs黏附MV9G细胞无影响，以浓度依赖方式可逆性抑制CAVs细胞内复制。白黎芦醇可能通过抑制IE62基因的转录和表达而抑制VZV感染的早期阶段。

宇香色酮和槲皮素体外抑制水痘-带状疱疹病毒作用机制比较

目的：应用基于水痘-带状疱疹病毒（VZV）报告细胞系MV9G建立的报告细胞法比较宇香色酮和槲皮素体外抑制VZV的作用机制。方法测定宇香色酮、丁子香酚、桑色素、姜黄素、杨梅黄酮、槲皮素等中药或植物成分体外抑制 VZV 的选择指数（SIs），进一步应用无细胞病毒（CFVs）直接感染法和带细胞病毒（CAVs）共培养法分析SIs较高的化合物在直接灭活CFVs、抑制CFVs黏附和穿透、抑制CAVs细胞内复制、抑制病毒即刻早期基因62（IE62）转录和表达等方面的作用。结果宇香色酮和槲皮素SIs相对较高，分别为5.82和8.97。宇香色酮部分灭活CFVs并抑制CFVs黏附和穿透MV9G细胞，槲皮素无此作用。宇香色酮和槲皮素可逆性抑制CAVs细胞内复制以及病毒IE62基因转录及IE62抗原表达，但宇香色酮需在感染12 h内加入。结论宇香色酮和槲皮素体外抑制VZV作用机制有差异，抑制病毒IE62基因转录和表达是其共同机制之一。