变性梅毒重组抗原免疫印迹技术的建立及其在鉴别梅毒血清学假阳性实验的应用

目的为了评估临床梅毒抗体筛查中出现假阳性实验结果的真实性,建立了变性梅毒重组抗原免疫印迹技术,并应用于对临床非高危人群梅毒抗体筛查阳性血清进行验证确认,分析出现假阳性的可能性。方法采用梅毒TP47,TP45,TP17和TP15重组抗原,将变性后的抗原与非变性的抗原配对包被在硝酸纤维膜载体上,建立梅毒免疫印迹抗体谱检测方法。收集临床经电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测的梅毒螺旋体抗体假阳性的非性病高危人群门诊和住院患者血清样本56例、临床确认梅毒患者血清样本25例和健康体检人员样本30例进行方法学验证。并用该方法对1例特殊的“梅毒患者”进行了鉴别。结果根据建立的变性与非变性抗原配对梅毒免疫印迹抗体谱检测结果判定模式,56例临床梅毒螺旋体抗体筛查假阳性样本,对四种变性重组抗原均不发生反应,无阳性条带。但是对二种以上非变性抗原发生弱阳性反应,出现阳性条带;25例梅毒患者对照样本,对四种非变性和变性重组抗原均有反应,出现强阳性条带;30例健康体检人员样本,对四种非变性和变性重组抗原均无反应。梅毒螺旋体特异性抗体阳性特殊“梅毒患者”血清样本,对四种变性重组抗原均为阴性反应,但对四种非变性重组抗原出现阳性反应。患者样本经血清免疫固定电泳分析,结合临床资料诊断为IgGλ型单克隆免疫球蛋白血症。结论变性梅毒重组抗原免疫印迹抗体谱检测,可有效鉴别临床梅毒抗体假阳性样本。但是,对于梅毒患者的确认一定要将检验结果结合患者的流行病学史、临床表现等进行诊断。

流式荧光免疫技术检测抗核抗体谱的性能与临床应用评价

目的分析流式荧光免疫技术(FFIA)检测自身抗体谱的结果及评价其在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的应用价值。方法用流式荧光免疫法和免疫印迹法同时检测219例自身免疫病患者(包括92例SLE患者和127例非SLE的其他自身免疫病患者)、231例其他疾病患者、50例健康体检者血清的特异性自身抗体(抗nRNP、Sm、SS-A、SS-B、Jo-1、Scl-70、rRNP、PCNA、Nucleosome、Histone、CenP-B、M2、dsDNA),计算两种方法的阴阳符合率,并采用Kappa检验评估结果一致性;采用受试者工作特征曲线(ROC)比较各抗体在系统性红斑狼疮诊断中的应用价值。结果FFIA与免疫印迹法检测各项自身抗体总符合率在87%至98%之间,Kappa值在0.179至0.854之间,其中抗CenP-B抗体一致性最好(Kappa值=0.854),抗His抗体一致性最差(Kappa值=0.179)。在219例自身免疫病例组数据中,根据试剂盒给定的阳性结果判断标准得到的免疫印记法灵敏度(62.0%)高于流式荧光(44.6%),而特异性略低于后者,分别为89.8%和94.4%,但二者诊断符合率基本一致且较好,分别为80.3%和77.3%。在用流式荧光免疫法检测各抗体用于SLE诊断的效能比较中,绘制ROC曲线结果显示抗dsDNA抗体对SLE诊断价值最高,AUC为0.768,其最佳cut-off值为10.94IU/mL,此时对SLE和非SLE自身免疫性疾病判断的灵敏度为65.2%,特异性87.4%,总符合率为78.1%,其他各项在最佳cut-off值时,抗Sm抗体的特异性(92.1%)最高,但灵敏度(28.3%)较差,抗CenP-B抗体的特异性(16.5%)最差,但灵敏度(100%)最高。结论FFIA检测抗核抗体谱与免疫印迹技术相比,一致性尚可,阴性符合率较阳性符合率更高,总符合率较好。FFIA检测抗dsDNA抗体、抗rRNP抗体、抗nRNP抗体、抗Nucl抗体和抗Sm抗体用于SLE诊断效能较好,且FFIA可实现自动化、大规模化、高效化检测。实验室在日常工作中可结合自身工作量、临床需求等选择适合本实验室流程的方法学。

抗HCV国家参考品的研制

目的 建立新的抗HCV国家参考品,促进国产抗HCV试剂的发展。方法 从全国各地收集供血员及丙型肝炎病人血样4000多份,应用10多种抗HCV EIA试剂筛选,应用免疫印迹及HCV PCR方法进行确证,并会同26家单位进行会同标定。结果 新参考品由40份抗HCV阴性样品及40份抗HCV阳性样品组成,阳性样品中有单独某一种抗体阳性的样品,有同时含有某两种抗体的样品,也有同时含有4种抗体的样品。结论 新参考品针对试剂存在的问题及发展方向,对研究开发和筛选高质量的丙肝抗原提供了参考数据,并为国产试剂的质量控制提供了标准。

国产抗HCV酶联免疫诊断试剂质量分析

目的 了解国产抗HCV EIA试剂的质量情况。方法 用16种国产抗HCV EIA试剂盒和2种进口试剂对1426份来源于血站及医院的血清进行了检测,并对疑难样品用RIBA及PCR试剂进行了确证。对各种试剂的灵敏度,特异度及检测的抗体谱进行了分析。结果 目前国产试剂灵敏度不低于国外试剂,特异度尚有待于改进。国产试剂漏检及假阳性的主要原因为HCV NS3区抗原相对较弱,抗原纯度较低,用量不足,有待于改进。结论 国产抗HCV试剂灵敏度不低于国外试剂,特异度有待提高。

免疫印迹法检测ENA及其在自身免疫性疾病中的诊断价值分析

目的探讨免疫印迹法(IBT)检测ENA抗体在自身免疫性疾病中的诊断价值。方法应用IBT和免疫斑点技术对临床常见的自身免疫性疾病(143例)和31例健康者做对照组进行了抗ENA抗体检查,同时观察了IBT和免疫斑点技术与间接免疫荧光法检查抗核抗体(IFANA)结果的相关性。结果 143例送检标本IBT法检测ENA多肽抗体谱总阳性率为80.4%,且检出一种或一种以上抗ENA抗体,系统性红斑狼疮27例(88.89%),皮肤炎和多发性肌炎16例(62.50%),干燥综合征28例(92.86%),混合性结缔组织病12例(91.67%),类风湿关节炎60例(66.68%);斑点法检测ENA多肽抗体谱总阳性率为54.54%,且检出一种或一种以上抗ENA抗体,其中系统性红斑狼疮27例(51.85%),干燥综合征26例(85.71%),类风湿性关节炎26例(43.33%),结缔组织病8例(66.67%),皮肌炎及多发性肌炎5例(31.25%)。结论免疫印迹技术(IBT)敏感性好,特异度高,并对自身免疫性疾病的诊断、治疗及预后有重要的参考价值,而ANA检测仍可作为自身免疫性疾病筛查的常规指标。

134例自身免疫性肝病患者自身抗体的分析

目的:探讨自身免疫性肝脏疾病的自身抗体特征,以提高对该病的认识。方法:在134例患者中,原发性胆汁性肝硬化(PBC)73例,自身免疫性肝炎(AIH)43例,原发性硬化性胆管炎(PSC)4例,乙型病毒性肝炎(HBV)3例,丙型病毒性肝炎(HCV)6例,非甲￣戊型病毒肝炎(NonA-E)5例。采用间接免疫荧光法、免疫印迹法等分别检测抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗肝肾微粒体抗体Ⅰ型(LKM-1)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/LP)和AMA-M2亚型等。结果:6例LKM-1阳性,6例SLA/LP阳性,分别见于AIH、AIH/PBC重叠综合征和HCV患者。PBC患者AMA和AMA-M2阳性率为94.5%,ANA阳性率为90.4%,以胞浆型为主(32/66)。AIH患者的ANA阳性率为90.7%,以核膜型为主(19/39)。非甲￣戊组,2例AMA和AMA-M2阳性,1例SMA阳性。结论:检测自身抗体有助于该病的诊断,临床不能忽视肝功能异常的患者,诊断时应考虑可能患有自身免疫性肝病。

3种抗双链DNA抗体检测方法比较及其联合检测对系统性红斑狼疮的诊断价值研究

目的分析间接免疫荧光法(IIF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法(IBT)检测抗双链DNA(dsDNA)抗体的差异,以及联合检测在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的应用价值。方法选取2012年1月至2015年3月确诊的SLE患者50例,以及同期其他自身免疫病(AID)患者100例和体检健康者100例。分别采用3种方法检测其血清抗dsDNA抗体,比较3种方法的灵敏度与特异度,并分析3种方法联合检测的灵敏度与特异度。结果IIF法特异度(99.5%)最高,ELISA法灵敏度(74.0%)最高。IIF与ELISA法、IIF与IBT法、ELISA与IBT法检测SLE患者抗dsDNA抗体的检出率比较,差异均有统计学意义(χ~2值分别为11.435、13.994、4.539,P<0.05);且一致性检验的Kappa值(κ)分别为0.411、0.522、0.278。3种方法串联检测特异度提高到99.5%,并联检测的灵敏度提高到82.0%。结论 3种检测抗dsDNA抗体的方法中,IIF特异度最高,ELISA灵敏度最高,联合检测可提高检测灵敏度与特异度。

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。

免疫印迹法检测可提取核抗原多肽抗体的评价

目的评价免疫印迹法(IB)检测可提取核抗原(ENA)多肽抗体的性能。方法以检测抗ENA抗体中的抗U1RNP抗体为研究对象,用免疫印迹法(IB)和免疫双扩散法(ID)分别进行检测,以高特异的ID法检测结果为对照,统计IB法的符合率。结果用IB法检测抗U1RNP抗体有7种不同的蛋白质排列组合,其中以73,32,17.5kDa三条蛋白带同时出现与ID法的符合率最高(84.1%),而32kDa的符合率最低(30.7%),这两组的差异最显著(P<0.01)。结论单独采用IB法检测抗ENA抗体尚欠可靠,须结合其它方法,取长补短,提高ENA抗体检测的敏感性、特异性。

两种方法联合检测自身免疫性疾病中ANCA的临床意义

目的评价间接免疫荧光法(IIF)和免疫印迹法检测抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)的临床意义。方法采用IIF和免疫印迹法联合对126例自身免疫性疾病患者的血清进行ANCA检测。结果在126例患者中类风湿关节炎(RA)、韦格纳肉芽肿瘤(WG)、皮肌炎(DM)和过敏性紫癜患者血清检测cANCA阳性与PR3-ANCA阳性是一一对应的;而在51例SLE患者中,有17例(33.3%)pANCA阳性,7例(13.7%)骨髓过氧化物酶(MPO)-ANCA阳性;在29例RA中3例(10.3%)pANCA阳性,而4例(13.7%)MPO-ANCA阳性。WG和ANCA相关性血管炎患者检测ANCA阳性率较高,分别为87.5%和93.7%。结论IIF一般情况下可以作为临床常规检测ANCA的筛选试验,免疫印迹法可以作为特异ANCA确证试验。二者联合应用可以提高ANCA的检出率,减少ANCA的误诊率。

检测抗核抗体谱在系统性红斑狼疮诊治中的意义

目的探讨抗核抗体谱(ANAs)检测在系统性红斑狼疮(SLE)诊治中的应用价值。方法对102例SLE(SLE组)、32例其他风湿性疾病(疾病对照组)及30名健康体检者(正常对照组),分别采用间接免疫荧光法、免疫印记法测定血清中抗核抗体(ANA)和ANAs中15种抗体的水平。结果 SLE组ANA和ANAs中抗nRNP/Sm抗体、抗Sm抗体、抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体及抗核糖体P蛋白抗体阳性率与疾病对照组和正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。SLE组2项及以上抗体阳性者占93.1%。ANA、抗Sm抗体、抗双链DNA抗体及抗核小体抗体同时阳性且资料完整的20例SLE住院患者治疗后上述抗体均有不同程度的转阴和(或)滴度下降。结论联合检测动态观察ANAs对SLE的诊断及治疗具有重要意义。

蛋白芯片技术在检测自身抗体中的应用探讨

目的评价蛋白芯片技术对自身抗体检测的敏感性和特异性,及其在常见自身免疫性疾病中的临床应用价值。方法采用蛋白芯片技术(在1张芯片上同时检测8项自身抗体),对214例自身免疫性疾病患者和43例健康体检者进行检测,并与免疫印迹法比较。结果检测抗Rib-P以蛋白芯片法的敏感性高于免疫印迹法(P<0.05),检测抗-SSB以蛋白芯片法的敏感性低于免疫印迹法(P<0.05),而抗-dsDNA、抗-Smith、抗-RNP、抗-SSA、抗Scl-70、抗J0-1的敏感性与免疫印迹法比较,差异无统计学意义(P>0.05),且这8项抗体的特异性均为100%。结论蛋白芯片法可同时检测8项自身抗体,操作方便、快速、敏感性高、特异性强,是常见自身免疫性疾病的辅助诊断方法 ,值得临床推广应用。

牛舌粘膜间接免疫荧光法与免疫印迹法检测天疱疮抗体的比较

目的比较以牛舌粘膜作为底物，间接免疫荧光法与免疫印迹法对检测天疱疮抗体的灵敏度和价值。方法以牛舌粘膜作为底物，分别应用间接免疫荧光法和免疫印迹技术检测１６例天疱疮患者血清中ＩｇＧ型自身抗体。结果间接免疫荧光法１４例（８７５％）阳性，免疫印迹法１１例（６８８％）阳性，两法合用总阳性１５例（９３８％）。结论间接免疫荧光法适合于常规辅助诊断天疱疮，而免疫印迹法可以作为前者的补充。

钙调素抗体的制备和鉴定

将从猪脑中所得SDS—PAGE纯的钙调素进行化学修饰,得(DNPm—CaM)n—BSA。将此修饰物免疫California白兔得抗血清。钙调素的ELISA测定表明:抗血清与天然牛脑和天然猪脑钙调素、CaBP_(72)(钙结合蛋白,分子量72KDa)、CaN(神经钙蛋白)、TnI(肌钙蛋白抑制亚单位)的交叉反应率分别为100％、100％、0.7％、0.4％、0.02％;与CaBP_(11)、CaBP_(12)、TnT、TnC、S—100、MLC(肌球蛋白轻链)均无交叉反应。免疫转移鉴定技术示:大鼠脑匀浆上清液显示强弱两条区带,强染色带相当于钙调素的位置,弱显色带分子量小于钙调素;其它所测大鼠组织匀浆上清液只在钙调素位置显示单一区带。

幽门螺杆菌的血清学诊断

目前幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的实验诊断技术已日益完善,临床上常用的诊断方法包括细菌形态观察,细菌尿素酶活性测定,血清抗 Hp 抗体测定、细胞 DNA 检测及粪便 Hp 抗原检测.毋庸置疑,经内镜取材的标本进行快速尿素酶试验及组织病理学检查是确诊 Hp 感染的常用方法.但侵入性诊断在某些情况下并不适用,因此血清学检测和尿素呼吸试验等无创性检测方法也具广泛用途,而血清学检测被视为流行病学调查的首选方法.

免疫印迹技术检测七种结缔组织病自身抗体

以兔胸腺可提取性核抗原（ＥＮＡ）的免疫印迹技术（ＩＢＴ），对１７７例结缔组织病患者及３２例正常人血清进行了７种自身抗体的测定。抗Ｓｍ抗体见于５０％的ＳＬＥ患者，敏感性较高；抗ＲＮＰ抗体可在多种结缔组织病中测出，在ＳＬＥ中阳性率较高；抗Ｒｏ（ＳＳＡ）、抗Ｌａ（ＳＳＢ）抗体见于部分ＳＬＥ患者；抗核糖体抗体仅见于ＳＬＥ，可能为ＳＬＥ的又一标记。本文ＩＢＴ具有广谱、快速、精确及稳固等优点，对提高结缔组织病的诊断和鉴别诊断水平有重要意义。

蛋白芯片技术及免疫印迹技术检测抗核抗体的比对研究

目的通过比对免疫印迹法与蛋白芯片法对血清标本中抗核抗体的检测结果,验证这两种方法是否具有等效性。方法分别用免疫印迹技术和蛋白芯片技术检测70例临床标本的抗核抗体,记录检验结果,并对检查结果进行统计学分析。结果经配对资料卡方检验分析,两种方法测定SSA、SSB、SM、Scl-70、Jo-1和CENP时结果差异无统计学意义(P>0.05)。仅在测定RNP时结果差异有统计学意义(P=0.04)。结论两种检测方法所测抗核抗体的结果一致性较好,蛋白芯片技术可用于临床抗核抗体的检测。

日本血吸虫与华支睾吸虫和姜片虫之间的交叉抗原及其血清学反应性

应用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离ＡＷＡ、ＣＳＡ和ＦＳＡ三种抗原的组分蛋白后，再以酶联免疫印迹技术（ＥＬＩＢ）进一步鉴定其组分蛋白的特异性蛋白带，分别显示１２条、１９条和２１条，其分子量（ＭＷ）范围分别为１３～６４ｋＤｅ、１６～１９８．５ｋＤａ和１４～１５０ｋＤａ。ＡＷＡ组分蛋白与兔抗ＳＥＡ免疫血清出现３条交叉反应带．ＭＷ为１７ｋＤａ、１４ｋＤａ和１３ｋＤａ，与抗ＣＳＡ的兔血清及华支睾吸虫病人血清显示３条（３８ｋＤａ、１７．５ｋＤａ及１７ｋＤｅ）交叉反应带．与抗ＦＳＡ的兔血清及姜片虫病人血清呈现５条（６４ｋＤａ、５９ｋＤｅ、５３ｋＤｅ、１７．５ｋＤａ和１７ｋＤａ）交叉反应带。实验结果表明，日本血吸虫成虫不仅与其虫卵之间存有交叉抗原，而且与华支睾吸虫和姜片虫成虫之间也存有交叉抗原及血清学交叉反应性。本研究为今后制备特异的血吸虫病血清学诊断抗原，提供了科学依据。

血清结核分枝杆菌复苏因子抗体检测方法的建立及其在肺结核诊断中应用价值的评价

目的建立结核分枝杆菌复苏因子抗体（RpfE—Ab）免疫印迹检测方法，并评价其在肺结核诊断中的应用价值。方法以原核表达结核分枝杆菌复苏因子蛋白作为抗原，应用免疫印迹法检测88例确诊肺结核患者血清和100例健康人血清中RpfE—Ab，并将结果与TSPOT-TB、抗结核抗体（LAM-Ab）结果进行比对。结果1：血清结核分枝杆菌复苏因子抗体检测方法在诊断肺结核中的敏感性为82．9％，特异性为92．0％。2：血清结核分枝杆菌复苏因子抗体检测方法在诊断肺结核中与TSPOT-TB、LAM—Ab检测方法之间无差异（χ2=0.92，P〉0．05，χ2=0．02，P〉0．05）。结论血清结核分枝杆菌复苏因子抗体检测可与TSPOT-TB、LAM—Ab同时作为肺结核辅助诊断方法。

自身免疫性肝病患者自身抗体的检测及临床应用

目的了解自身免疫性肝病患者可能出现的各种自身抗体阳性率,以提高对该病的认识。方法分别应用间接免疫荧光法和免疫印迹法检测92例自身免疫性肝病患者和30名健康人的抗核抗体(ANA),抗平滑肌抗体(SMA),抗线粒体抗体(AMA)、AMA-M2、抗肝肾微粒体Ⅰ型(LKM-1)抗体、抗可溶性肝抗原/抗肝胰抗原(SLA/LP)抗体、抗核点(Sp100)抗体、抗核膜(gp210)抗体、抗肝细胞胞质抗原1型抗体(抗LC-1抗体)。92例患者分为4组:自身免疫性肝炎27例;原发性胆汁性肝硬化29例;原发性硬化性胆管炎6例;不明原因肝损伤30例。结果自身免疫性肝炎组ANA、SMA、抗LKM-1抗体、抗SLA/LP抗体、抗LC-1抗体的阳性率分别为81.5%、51.9%、11.1%、18.5%、14.8%。原发性胆汁性肝硬化组ANA、AMA、AMA-M2、抗Sp100抗体、抗gp210抗体阳性率为89.7%、93.1%、89.7%、58.6%、31.0%。原发性硬化性胆管炎组检测ANA 1例(16.7%),不明原因肝损伤ANA 9例(30%),AMA 3例(10%)。结论多数自身免疫性肝病伴有特异性自身抗体的出现;自身抗体的检测对临床肝病学具有重要的意义。