碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。

重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论

抗乙酰胆碱受体单链抗体在大肠杆菌中的表达

[目的 ]使构建的抗人乙酰胆碱受体单链抗体基因在大肠杆菌中表达 .[方法 ]将含有单链抗体基因的载体 pHEN2 (含有 pelB引导肽和c myc)转化大肠杆菌HB 2 15 1,在细菌外周质中表达单链抗体 .应用鼠抗c myc单链抗体的斑点杂交试验检查细菌外周质裂解物中单链抗体的表达 .[结果 ]单链抗体表达在细菌外周质中 ,培养液上清及对照大肠杆菌外周质和培养液上清均未发现单链抗体 .[结论 ]已成功地在大肠杆菌中表达了抗人乙酰胆碱受体单链抗体 .

重庆地区FcγRⅡB基因多态性与Graves病的相关性研究

目的了解重庆地区汉族人群FcγRⅡB基因多态性位点rs17416919(703A>T,204Tyr>Phe)的基因型分布,探讨该基因多态性与Graves病(GD)的相关性以及其基因型与甲状腺自身抗体、发病年龄、家族史和眼征的关系。方法选取重庆地区562例GD患者列入病例组,以260例正常人作为对照。采用聚合酶链反应-限制片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP),对FcγRⅡB基因外显子4区单核苷酸多态性(SNP)位点rs17416919(703A>T,204Tyr>Phe)进行基因分型,对受试者进行甲状腺功能和自身抗体的检测。对rs17416919位点不同基因型与GD及其发病年龄、甲状腺自身抗体、家族史、甲状腺肿和突眼体征进行相关性分析。结果FcγRⅡB多态性位点rs17416919的三种基因型TT、AT、AA频率在病例组分别为0.7%、22.1%、77.2%,在对照组分别为0.4%、20.4%、79.2%,经非条件Logistic回归校正年龄和性别因素后计算,在共显性、显性和隐性3种模式下比较,两组差异均无统计学意义(P>0.05)。病例组和对照组等位基因频率分布差异亦无统计学意义(χ2=0.480,P>0.05)。除甲状腺疾病家族史(χ2=5.349,P<0.05)外,余甲状腺自身抗体、发病年龄和眼征在TT+AT和TT基因型之间相比,其差异均无统计学意义(P>0.05)。结论重庆地区汉族人群FcγRⅡB基因多态性位点rs17416919(703A>T,204Tyr>Phe)与GD遗传易感性无相关性。

人源性TRAb Fab段单克隆抗体的筛选和鉴定

目的通过噬菌体表面展示技术,运用已构建的人源性噬菌体抗体库,筛选、表达人源性促甲状腺激素受体抗体(TRAb)Fab段。方法以人TSHR膜外区的氨基端(h TSHRn)、人TSHR膜外区的羧基端(hTSHRc)的融合蛋白为抗原,通过数轮"吸附-洗脱-扩增"富集噬菌体抗体,筛选阳性克隆。从已构建的抗体库中筛选到甲状腺刺激性抗体(TSAb)Fab、甲状腺阻断性抗体(TBAb)Fab,噬菌体(Phage)-ELISA检测选取阳性克隆,PCR及双酶切鉴定TRAb阳性克隆。检测可溶性TRAb Fab片段阳性克隆的表达,Western blotting鉴定TRAb阳性克隆的免疫学活性,对TRAb Fab阳性克隆进行测序分析。结果经过5轮富集筛选,成功筛选到特异性TRAb(TSAb、TBAb)Fab噬菌体抗体,产率分别提高约77、94倍。通过Phage-ELISA检测,鉴定出了具有抗原结合活性的单克隆抗体,实现可溶性表达。Western blotting证实其免疫学活性。测序分析单克隆48的轻链可变区与人的免疫球蛋白轻链Vλ同源性达到94.4%,重链可变区与人的免疫球蛋白IgG重链VH4同源性为88.9%。克隆56的轻链可变区与人的免疫球蛋白轻链Vλ同源性达到95.6%,重链可变区与人的免疫球蛋白IgG重链VH3同源性为84.6%。结论本研究通过成功筛选获得人源性TRAb(TSAb、TBAb)Fab片段的单克隆抗体。

抗乙酰胆碱受体单链抗体基因克隆与表达

目的重建含有抗乙酰胆碱受体(AChR)单链抗体1929#(single-chain Fv antibody 1929#,scFv1929#)基因的载体并在大肠杆菌(E.coli)进行表达,提高scFv1929#的可溶性表达量。方法用聚合酶链反应法(PCR)扩增载体pHEN1中的scFv1929#结构基因,将扩增产物定向克隆至载体pET32a(+)的多克隆位点中构建新的载体pET32a(+)-scFv1929#,经EcoR v和NotⅠ双酶切后进行鉴定,并将所构建载体转化入表达宿主E.coli BL21(DE3)plysS菌株内诱导表达后集菌并裂菌,将诱导前菌体、诱导后菌体,以及裂菌后所得诱导后上清、诱导后沉淀进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,并采用Western blot(WB)法进行鉴定。结果鉴定结果显示载体pET32a(+)-scFv1929#中所插入的scFv1929#基因片段大小为730bp,与预计相符,经测序确定该基因序列无误。SDS-PAGE电泳结果显示37℃下诱导前菌体、诱导后菌体、诱导后上清、诱导后沉淀中均可在相对分子质量(Mr)接近44 000处见到蛋白条带,其中诱导后菌体及诱导后沉淀中的条带较粗大。经WB法证实融合蛋白scFv1929#具有较高特异性。结论 scFv1929#表达载体pET32a(+)-scFv1929#被成功构建,并可在大肠杆菌中高效表达,其表达产物具有较好特异性。

AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建人AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体AChR-IgG Fc/pAN1782并在CHOk1细胞中表达AChR-IgG Fc融合蛋白。方法以人烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)α1亚基全序列为模板,以PCR法扩增AChRα1亚基胞外段主要免疫区基因片段Hα1-121,将其插入真核表达载体pAN1782。将构建的新载体转染至CHOk1细胞,建立稳定表达AChR-IgG Fc融合蛋白的CHOk1细胞株,以Western blot法检测AChR-IgG Fc融合蛋白表达。结果 (1)Hα1-121经PCR法扩增后所获428 bp基因片段大小符合预计结果,测序所得核苷酸序列与人类基因库中AChRα1亚基胞外段基因片段Hα1-121序列完全一致,未出现点突变或移码突变。所构建的新载体经酶切鉴定证实片段插入正确,载体构建成功。(2)Westernblot法检测结果显示转染新载体的CHOk1细胞培养上清液中有AChR-IgG Fc融合蛋白表达。结论成功构建人AChR-IgG Fc段融合蛋白真核表达载体,且该融合蛋白可在转染新载体的CHOk1细胞中稳定表达,为下一步靶向B细胞治疗重症肌无力奠定了初步良好基础。

抗乙酰胆碱受体单链抗体酵母表达的特性鉴定

[目的]探讨毕赤酵母GS115表达的重症肌无力单链抗体A7的一般特性及与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的结合特异性.[方法]采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹试验,检测已经转化至毕赤酵母GS115中的重症肌无力重组载体pPIC9K-ScFvA7表达的单链抗体A7蛋白的分子质量;应用间接免疫荧光技术确定表达蛋白与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体的亲和性.[结果]毕赤酵母GS115培养上清液中有目的蛋白的表达,分子质量约为44ku;间接免疫荧光试验显示,在大鼠肋间肌细胞间有荧光出现.[结论]单链抗体A7可以在毕赤酵母中成功地表达,并且可与大鼠肋间肌乙酰胆碱受体结合.

免疫球蛋白G Fc受体1C在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的探究免疫球蛋白G Fc受体1C(FCGR1C)在肝细胞癌(HCC)组织中表达的临床意义及与HCC细胞白细胞介素1β(IL-1β)和恶性表型的关系。方法用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测90例HCC组织及相应癌旁组织中FCGR1C的表达水平,并用Kaplan-Meier Plotter数据库分析FCGR1C与HCC患者预后的关系。在人HCC细胞HepG2中用慢病毒转染FCGR1C siRNA表达载体及对照载体分别作为实验组及对照组,用RT-qPCR法检测细胞中FCGR1C和IL-1βmRNA的表达水平,用CCK-8实验法检测细胞的增殖能力,用Transwell实验法检测细胞的侵袭和迁移能力。结果在HCC癌组织和癌旁组织中的FCGR1C表达水平分别为(2.34±0.29)×10^(-2)和(1.40±0.19)×10^(-2),差异有统计学意义(P<0.01)。FCGR1C高表达与HCC患者预后不良显著相关(风险比=1.47,P<0.05),并与患者TNM分期呈正相关(P<0.05)。FCGR1C与IL-1β在肝癌组织中的表达呈正相关(P<0.01)。实验组和对照组的FCGR1C mRNA表达水平分别为0.23±0.03和1.00±0.08,IL-1βmRNA表达水平分别为0.54±0.04和1.00±0.10,侵袭细胞数分别为(22.00±3.93)和(53.20±3.50)个,迁移细胞数分别为(48.80±5.40)和(102.20±7.94)个,96 h增殖能力分别为17.41±1.48和23.93±1.92,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论FCGR1C在HCC组织中高表达且不利于患者预后,其可促进HCC细胞体外增殖及转移能力,并上调IL-1β的表达水平。

新型冠状病毒受体结合域-Fc融合蛋白表达及小鼠免疫原性

目的表达制备新型冠状病毒刺突蛋白的受体结合域(receptor binding domain, RBD)-Fc融合蛋白, 并评价其在小鼠模型中的免疫原性。方法将新型冠状病毒RBD与小鼠免疫球蛋白Fc段融合基因在中国仓鼠卵巢细胞中表达并制备融合蛋白。将不同剂量的RBD-Fc融合蛋白分别单独或辅以氢氧化铝佐剂免疫小鼠, 通过ELISA、假病毒中和试验、酶联免疫斑点试验检测诱导产生的体液和细胞免疫应答。结果 10 μg RBD-Fc融合蛋白辅以氢氧化铝佐剂能有效诱导小鼠产生良好的RBD特异性IgG抗体应答, 该抗体可阻断病毒RBD与细胞表面病毒受体的结合, 进一步研究表明该重组蛋白还诱导产生了针对原始毒株、Beta变异株和Delta变异株假病毒的中和抗体, 中和抗体滴度分别为1 566、336和270。结论制备的RBD-Fc融合蛋白具有较好的免疫原性, 可为开发COVID-19重组蛋白疫苗提供参考。

Fc融合蛋白在药学领域的研究进展

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物活性的功能蛋白分子与Fc片段融合而产生的新型重组蛋白,其不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如通过结合相关Fc受体延长半衰期和引发抗体依赖细胞介导的细胞毒性效应等。对Fc融合蛋白及其在药学领域的研究进展进行了综述。

单链抗体对重症肌无力致病性抗乙酰胆碱受体抗体的抑制

目的 探讨单链抗体 (ScFv)在体外对重症肌无力 (MG)的治疗作用。方法 从分离自MG患者胸腺的抗乙酰胆碱受体 (AChR)抗体构建单链抗体ScFv6 37,应用免疫荧光法、竞争性ELISA和竞争性放射免疫测定法 ,对ScFv6 37与人肌肉冰冻切片中AChR结合活性以及抑制致病性抗AChR抗体和MG患者血清与人AChR结合活性进行测定。结果 ScFv6 37能与人肌肉中神经肌肉接头处的AChR结合 ,对致病性抗AChR抗体与人AChR结合的抑制率可达 73 0 % ,对MG患者血清与人AChR结合的抑制率为 2 7 8%～ 4 5 5 %。结论 单链抗体在体外能抑制致病性抗AChR抗体与AChR的结合 ,对AChR具有保护作用。

人血管内皮生长因子受体-Fc在DG44细胞中的表达及其生物活性

目的在中国仓鼠卵巢细胞DG44中表达人血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-Fc,并检测其生物活性。方法化学合成人VEGFR1的第2免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)基因和人VEGFR2的第3免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)基因,通过重叠PCR(Overlap PCR)将VEGFR1D2-VEGFR2D3和人IgG1Fc拼接形成VEGFR-Fc融合基因,插入真核表达载体pD2中,构建重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc,在FreeStyleTMMAX Reagent和OptiPROTMSFM介导下转染至DG44细胞中,MTX加压筛选稳定表达VEGFR-Fc蛋白的细胞株,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法检测细胞培养上清中VEGFR-Fc蛋白的表达。表达的VEGFR-Fc蛋白经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,利用显微镜观察法和血管内皮细胞ECV304模型检测其生物活性。结果 VEGFR-Fc基因扩增产物大小为1 377 bp;重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc经双酶切和测序证明构建正确;质粒pD2-VEGFR-Fc转染的DG44细胞培养上清中含VEGFR-Fc蛋白,表达量为0.5 g/L;细胞培养上清经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,杂蛋白去除效果较好;纯化的VEGFR-Fc能与VEGF特异性结合,抑制ECV304生长。结论成功在DG44细胞中表达了具有生物活性的VEGFR-Fc,为进一步研究其在抑制血管生成和抗肿瘤中的作用奠定了基础。

重组Exendin-4-胰高血糖素样肽1/IgG4（Fc）融合蛋白的表达和活性研究

目的 构建表达长效胰高血糖素样肽1 （glucagon-1ike peptide 1,GLP-1）受体激动剂重组Exendin-4-GLP-1/IgG4 （Fc）融合蛋白的质粒载体,并研究该融合蛋白的活性.方法 将编码Exendin-4-GLP-1/IgG4（Fc）的重组基因插入表达载体pOptiVECTM-TOPO（R）来构建重组质粒Exendin-4-GLP-1/IgG4（Fc）-pOptiVECTM-TOPO（R）.将构建的重组质粒转染CHO/DG44细胞并收获表达产物后,分别用亲和层析法和免疫印迹法对表达产物进行纯化和检测.通过胰岛素释放实验确认重组融合蛋白对INS-1细胞胰岛素分泌的影响,同时在CD1小鼠中研究该融合蛋白对血糖的调节作用.结果 转染重组质粒的CHO/DG44细胞可成功表达Exendin-4-GLP-1/IgG4 （Fc）.蛋白质印迹法检测显示,纯化的表达产物的相对分子质量（Mr）与预期相符（重组融合蛋白单体和二聚体的Mr分别约为35 000和70 000）.胰岛素释放实验表明,在葡萄糖浓度恒定的情况下INS-1细胞分泌的胰岛素量随重组融合蛋白浓度的升高而增加.CD1小鼠实验显示,重组融合蛋白对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的血糖具有调节作用,Exendin-4-GLP-1/IgG4（Fc）处理的糖尿病小鼠的血糖明显低于对照糖尿病小鼠（F=3 194,P＜0.01）.结论 Exendin-4-GLP-1/IgG4（Fc）具有天然GLP-1的活性,可作为GLP-1受体激动剂用于2型糖尿病的治疗.