PCR-RFLP检测输入性恶性疟原虫Pfcrt基因多态性

目的了解来自不同流行区输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T的点突变情况,探讨恶性疟原虫Pfcrt基因多态性。方法采集2008-2012年从非洲(尼日利亚、赤道几内亚、刚果、利比里亚、安哥拉和马里)和东南业(缅甸和印度尼西亚)等疟疾流行区回国人员恶性疟现症患者血样共72份,根据恶性疟原虫Pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以血样中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢式PCR,扩增产物经限制性内切酶ApoⅠ酶切后鉴定。结果 72份输入性恶性疟现症患者血样中,71份扩增出目的条带。扩增产物酶切结果显示,突变型Pfcrt等位基因41份(57.7%,41/71),野生型Pfcrt等位基因30份(42.3%,30/71)。其中非洲6国.50份血样中,野生型和突变型各25份(50%,25/50);缅甸和印度尼西亚21份血样中,野生型5份(23.8%,5/21),突变型16份(76.2%,16/21)。结论来自不同流行区的恶性疟原虫分离株Pfcrt基因突变出现率不同。

输入性恶性疟原虫耐药相关基因Pfcrt和Pfmdr1单倍型及突变分析

目的了解目前山东省输入性恶性疟原虫抗药性基因Pfcrt和Pfmdr1的单倍型,分析突变基因型及其分布情况。方法根据恶性疟原虫Pfcrt和Pfmdr1基因序列设计套式PCR引物,对采自全省非洲务工返乡的输入性恶性疟感染者血样扩增,并对其产物进行基因测序和序列对比分析。结果 68例样本Pfcrt基因第72~76位点和Pfmdr1基因第86、1 042和1 246位点目的片段全部成功扩增和测序。Pfcrt基因中69.12%为野生单倍型CVMNK,30.88%为突变单倍型,突变型包括CVIET、CVIDT及混合型,其中CVIET数量最多。Pfmdr1基因中69.12%为野生单倍型NND,30.88%为突变单倍型,即YND及混合基因型。6个非洲输入来源国样本中,除几内亚Pfcrt基因全部为野生型外,其它国家Pfcrt和Pfmdr1基因均有突变型存在。5例样本Pfcrt和Pfmdr1基因共同表现为突变单倍型。结论山东省输入性恶性疟Pfcrt和Pfmdr1基因突变单倍型具有多样化特征。Pfcrt和Pfmdr1突变型比例均低于野生型,提示目前该省流行的输入性恶性疟未出现严重的氯喹耐药性。

输入性恶性疟原虫Pf60.1基因多态性初步研究

采用PCR方法扩增武汉市2010-2013年经镜检和巢式PCR确诊的101份国外输入性恶性疟病例血样的Pf60.1基因,研究Pf60.1基因多态性。PCR结果显示,共92份血样扩增出3类基因片段,其中52份扩增出313 bp片段,占56.5%;34份扩增出340 bp片段,占37.0%;6份扩增出313 bp和340 bp混合型片段,占6.5%。83份自非洲地区输入病例血样中,46份扩增出313 bp片段,占55.4%,31份扩增出340 bp片段,占37.1%,6份扩增出混合型片段,占7.2%;9份自东南亚地区输入病例血样中,6份扩增出313bp片段,3份扩增出340bp片段。提示输入性恶性疟Pf60.1基因以313 bp基因型较多,并且可能存在多克隆感染情况。

输入性恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因突变关联性分析

目的了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗性基因1(pfmdr1)相关位点突变情况及其关联性。方法 2009-2016年,采集武汉市从非洲和东南亚等回国人员恶性疟患者血样,利用巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv对产物进行酶切,分析相关位点的突变性。结果 232例输入性恶性疟患者Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点的突变率分别为55.2%、17.2%、5.2%和8.6%,pfmdr1总突变率为26.3%;东南亚患者血样未检出pfmdr186和pfmdr11246位点突变;非洲输入性恶性疟患者Pfcrt76突变和未突变中pfmdr186、1042、1246位点及pfmdr1总突变率分别为28.6%、3.8%、12.4%、36.2%和10.4%、2.1%、7.3%、17.7%。患者症状与Pfcrt76、pfmdr186、1042、1246位点突变连锁不平衡分析,D′和r^2分别为0.230和0.018、0.290和0.004、0.996和0.012、0.150和0.035。结论输入地为非洲和东南亚缅甸的恶性疟原虫pfmdr1基因突变位点存在差异,Pfcrt76突变与pfmdr1突变和pfmdr186点突变呈正相关。

合肥市输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T位点突变研究

目的探讨合肥市输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T位点的突变情况。方法采集2010年从非洲疟疾高流行区,务工回国输入性恶性疟病人血样11份,采用恶性疟原虫Pfcrt基因序列特异引物,以滤纸血片中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢氏PCR扩增基因,扩增产物经限制性内切酶酶切后鉴定。结果收集到11例滤纸血样,成功扩增6例,其中2例被酶切,为Pfcrt等位基因野生型;4例未被酶切,为Pfcrt等位基因突变型。结论合肥市输入性恶性疟中Pfcrt等位基因发生突变,应该加强输入性恶性疟的药物抗性监测。

河南省2020年输入性恶性疟原虫Pfhrp2基因多态性分析

分析河南省2020年确诊的输入性恶性疟病例血样的恶性疟原虫富组氨酸蛋白2 (Pfhrp2)基因的缺失情况和外显子2区多态性。收集2020年河南省疟疾诊断参比实验室确诊的输入性恶性疟病例信息和血样,血样DNA进行巢式PCR扩增Pfhrp2基因外显子2区,阳性扩增产物进行测序。共收集确诊的输入性恶性疟病例血样37份,Pfhrp2基因外显子2区巢式PCR扩增阳性35份,阳性率94.59%(35/37)。35份扩增阳性产物中有28份测序成功,序列平均长度为822 bp。Pfhrp2基因外显子2区序列编码的氨基酸链共包含12种重复类型,均以1型(AHHAHHVAD)作为起始、12型(AHHAA)作为结束。28条氨基酸链均含有1型、2型、4型、11型和12型重复。其他重复类型占比从高到低依次为13型(96.43%,27/28),3型(92.86%,26/28),7型(82.14%,23/28),8型(64.29%,18/28),6型(60.71%,17/28),5型(46.43%,13/28)和9型(32.14%,9/28)。本研究结果显示,2020年河南省输入性恶性疟原虫虫株的Pfhrp2基因外显子2区片段存在高度多样性,可能会造成快速诊断检测结果的差异。

2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫氯喹抗性基因多态性分析

目的对2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫样本氯喹抗性分子标记位点基因多态性进行检测,分析恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine re sistant transporter,Pfcrt)第72~76位密码子抗性相关位点突变类型,并分析不同输入来源样本的特异性。方法收集2012年和2018年国家疟疾诊断参比实验室674例输入性恶性疟病例滤纸血样本,以样本中恶性疟原虫7号染色体上Pfcrt基因第72~76位点为扩增片段,采用巢式PCR法进行扩增并测序,对目的产物片段测序结果、地理分布等特征进行统计分析。结果2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例中,95.5%(644/674)来自非洲,其余4.5%(30/674)来自东南亚和大洋洲(巴布亚新几内亚);非洲又以西非和中非为主(占非洲样本的80.4%,518/644)。共检测到C72S、M74I、N75E、K76T 4个位点突变和5种单体型类型(CVMNK、CVIET、SVMNT和两种混合型),其中CVMNK与CVIET为非洲和东南亚地区恶性疟原虫共有的单体型类型,SVMNT仅在东南亚(缅甸)和巴布亚新几内亚输入样本中检测出;2种混合型为CVMNK/CVIET和CVMNK/SVMNT,前者在非洲和东南亚输入样本中分布,后者仅在东南亚缅甸来源样本中检出。自非洲输入的样本野生型较多,占77.7%(478/615);而自东南亚和巴布亚新几内亚输入的样本中,抗性分子标记样本占68.0%(17/25),两者差异有统计学意义(χ^2=28.5,P<0.05)。非洲不同地区来源样本中,抗性基因比例和野生型构成差异有统计学意义(P<0.01),西非野生型所占比例最低。结论2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例样本中,自东南亚输入的恶性疟原虫Pfcrt基因第72~76位点抗性基因比例和分子多态性均较非洲来源样本高。

2015—2016年山东省由赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的了解山东省由赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗性基因多态性情况。方法采集2015—2016年山东省由赤道几内亚务工返乡的输入性恶性疟患者血样,提取疟原虫基因组DNA,对恶性疟原虫抗性基因Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps、K13进行套式PCR扩增、DNA测序和序列对比分析。结果全部样本5种抗性基因目的片段均成功扩增和测序。Pfcrt野生型、突变型、混合型分别占72.8%、18.6%、8.6%,突变型全部为CVIET(下划线表示突变位点,下同);Pfmdr1野生型、突变型、混合型分别占20.0%、61.4%、18.6%,突变型主要为YF和NF;Pfdhfr野生型、突变型、混合型分别占1.4%、98.6%、0,突变型主要为AIRNI;Pfdhps野生型、突变型、混合型分别占1.4%、94.3%、4.3%,突变型主要为SGKAA;Pfdhfr和Pfdhps完全抗性基因型IRNGE占8.6%;1.4%的样本K13基因发生A578S突变。结论山东省由赤道几内亚输入的恶性疟原虫Pfcrt、Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps、K13基因均发生不同程度突变;Pfcrt突变型比例较低,Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps突变型比例较高;检测到K13基因发生A578S突变。

中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性分析

目的 分析中缅边境地区恶性疟原虫氯喹抗性相关基因的多态性。方法 收集2001-2012年中国云南省西双版纳州景洪市、缅甸克钦邦拉咱市和掸邦第二特区勐冒县恶性疟病例滤纸血标本175份,采用巢式PCR法扩增恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter gene,pfcrt)基因第72-76位点片段和多药耐药基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance gene 1,pfmdr1)基因第86-1246位点片段,并对扩增产物测序分析。结果 共检测到pfcrt基因5种突变型(CVIEK,CVIDK,SVMNT,CVIET,CVIDT),该3个地区均以三重突变型(CVIET)为主,其中,中国云南西双版纳CVIET由2001年的76.7%上升至2006年的100%,缅甸拉咱市由2001年的75%上升至2007年的95%,但2012年又下降至77.5%,缅甸勐冒县2009年该突变型占比为67.5%。共检测到pfmdr1基因5种单突变型(N86Y,E130K,Y184F,S1034C,F1226Y)和2种双重突变型(N86Y/F1226Y,Y184F/F1226Y),其中2001年西双版纳pfmdr1基因野生型占36.7%,N86Y和Y184F突变率均为20%,F1226Y突变率为16.7%,而2006年以F1226Y突变为主占40%,且检测到二重突变型(N86Y/F1226Y和Y184F/F1226Y)占8%;缅甸拉咱市pfmdr1基因Y184F突变率从2001年的25%升高至2007年的35%和2012年的37.5%,该3年中野生型分别占65%、40%和55%;2009年缅甸勐冒县pfmdr1基因野生型比例为47.5%,Y184和N86Y单突变型分别为27.5%和25%。结论 中缅边境恶性疟原虫pfcrt基因均以三重突变型(CVIET)为主,氯喹抗性均较高,可为中缅边境地区恶性疟的防治提供参考。