原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位，采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高；ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布，多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内，该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见；个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中，若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多。

地高辛素标记探针检测HFRS病毒基因研究

本实验用聚合酶链反应与随机引物标记法制备地高辛素标记的肾综合征出血热病毒核酸M、S片段cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交结果表明，该探针具有肾综合征出血热病毒的特异性，可检出10pgHFRSV-RNA。实验结果表明：抗原阳性鼠体螨10只组、5只组，抗原阴性鼠体螨10只组，游离螨50只组、10只组，抗原阳性鼠肺50mg、100mg组，所抽提RNA与探针杂交结果呈阳性，而抗原阴性鼠体螨5只组抽提RNA的探针检测结果呈阴性。

原位分子杂交检测HFRSVRNA方法研究

采用非放射性标记物－地高辛碱性磷酸酶标记肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）ｃＤＮＡ制备分子探针，检测ＨＦＲＳＶ在鼠肺、恙螨体内分布定位，并对原位分子杂交的各环节进行探讨。结果表明：鼠肺的吞噬细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞等均见有阳性颗粒，在恙螨卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞也存在阳性颗粒；在前处理中，明胶硫酸铬钾与多聚赖氨酸的铺片效果相似；室温２ｈ，４２℃１ｈ，４％多聚甲醛处理冰冻切片，可有效防止脱片，且保持良好的细胞形态结构；探针ＰＣＲ标记法优于随机引物标记法；预杂交液加入ｓｐｅｒｍＤＮＡ和ｙｅａｓｔｔＲＮＡ，不用硫酸萄聚糖，可有效地减少背景染色；４２℃杂交１６ｈ。

恙螨体内HFRSV基因检测及定位的初步研究

１９９７ 年以来我们采用分子生物学方法对小盾纤恙螨的媒介意义进行研究。结果表明， 用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｎｅｓｔｅｄ Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 从恙螨体内检测到 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓｒ－ Ｒ Ｎ Ａ； 用原位分子杂交技术在恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓ Ｕ－ Ｒ Ｎ Ａ。以上结果为恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据， 对 Ｈ Ｆ Ｒ Ｓ 的流行病学和预防具有重要的理论意义和实用价值。

恙螨体内汉滩病毒检测及定位的研究

采用分子生物学方法对小盾纤恙螨的媒介意义进行研究。结果表明：用ＲＴＰＣＲ和ＮｅｓｔｅｄＲＴＰＣＲ从恙螨体内检测到汉滩病毒ＲＮＡ；用原位分子杂交技术在恙螨的卵巢细胞、支肠细胞等组织中检测到汉滩病毒ＲＮＡ。以上结果为恙螨的媒介意义提供了具有分子水平的直接证据，对ＨＦＲＳ的流行病学和预防具有重要的理论意义和实用价值。

斑点杂交检测肾综合征出血热病毒核酸的研究

本研究用非放射性标记物—地高辛碱性磷酸酶标记肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）ｃＤＮＡ制备探针，检测恙螨、鼠肺中ＨＦＲＳＶＲＮＡ的ＲＴＰＣＲ扩增产物中目的片段。结果表明：ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠体螨５０只组、１０只组，游离螨５０只组、１０只组，ＨＦＲＳＶ抗原阳性鼠肺１０００ｍｇ、５００ｍｇ，抗原阴性鼠肺１０００ｍｇ检测结果为阳性，呈现明显紫褐色斑点，而ＲＴＰＣＲ检测时未能扩增出ＨＦＲＳＶ抗原阴性鼠肺１０００ｍｇ和游离螨１０只组中的目的条带。实验结果说明，斑点杂交检测方法比ＲＴＰＣＲ敏感。