甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控

背景:甲状旁腺素相关蛋白-印第安刺猬蛋白两者相互作用调节着骨骺区软骨的分化成熟及增殖,促使骨骺区细胞处于一种相对稳定的状态。目的:分析甲状旁腺相关蛋白亚基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)对骨骺干细胞的调控作用以及PTHrP(107-139)与其他调控因子的影响。方法:用脂质体介导的基因转染技术将质粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分别转染pTet-on骨骺干细胞株,放入诱导分化培养基中进行培养,加入1mg/L的强力霉素进行诱导,以RT-PCR的方法检测增殖细胞核抗原基因的表达变化。再次将质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染pTet-on骨骺干细胞株,加入不同浓度的强力霉素进行诱导,应用RT-PCR的方法检测Ⅱ型胶原、X型胶原、印第安刺猬蛋白、Ptc、Sox9、骨形态发生蛋白6基因的表达变化。结果与结论:强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组的增殖细胞核抗原表达明显高于质粒pTRE-PTHrP(1-36)转染组和质粒pTRE-PTHrP(38-94)转染组;在强力霉素诱导的质粒pTRE-PTHrP(107-139)转染组中Ⅱ型胶原、Sox-9表达明显增强,Ihh表达未见明显变化,而Ptc、X型胶原、骨形态发生蛋白6表达明显降低。而且其表达量与强力霉素存在剂量依赖性。提示PTHrP(107-139)可能是通过调控Sox-9、Ptc、骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的,而PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)对前癌干细胞的增殖并无明显作用。pTet-on质粒系统在前癌干细胞能有效的调控外来基因的表达。

不同咀嚼负荷对幼兔髁突软骨内印度豪猪蛋白-人甲状旁腺激素相关蛋白通路表达的影响

目的分析不同咀嚼负荷作用下,幼兔髁突软骨内印度豪猪蛋白(Ihh)-人甲状旁腺激素相关蛋白(PThrP)通路表达的差异性,探讨咀嚼应力负荷对髁突软骨Ihh-PThrP信号通路的影响。方法选取10d龄幼兔48只,随机分为硬食组和软食组,分别喂以同种颗粒状(硬食)和粉状(软食),于饲养的第2、4、6、8周处死。采用苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学、免疫印迹、实时定量荧光聚合酶链反应检测Ihh和PThrPmRNA和蛋白的动态变化。结果HE染色显示硬食组髁突软骨厚度高于软食组的厚度;第2、4、6、8周,Ihh蛋白、PThrP蛋白和mRNA表达量在两组中呈递减趋势;软食组中Ihh和PThrP蛋白以及mRNA表达量显著低于硬食组。结论较低的咀嚼负荷会造成髁突软骨生长因子Ihh和PThrP分泌减少,Ihh-PThrP通路表达迟缓,软骨发育受阻碍;适当的咀嚼负荷对髁突的正常发育有至关重要的作用。

甲状旁腺相关蛋白及其受体PTH1R及Ihh信号在鼠胚髁突软骨中的分布特征

目的 探讨甲状旁腺相关蛋白（PTHrP）及其受体PTH1R及Ihh信号在髁突软骨发育过程中的分布特征及意义。方法 取E14～18d鼠胚，以免疫组化及原位杂交染色方法，检测PTH1R抗体及PTHrP、Ihh mRNA在下颌髁突软骨发生过程中的分布特征。结果 在鼠胚下颌髁突软骨发育过程中，PTHrP、PTH1R主要表达于软骨膜间质细胞、软骨细胞及大部分肥大软骨细胞中，Ihh主要位于肥大软骨细胞上层及其与扁平细胞层交界处，PTHrP及Ihh信号可能通过自分泌和（或）旁分泌作用调控髁突软骨细胞的增殖和分化。结论 鼠胚下颌髁突软骨发育过程中，PTHrP、PTHA1R、Ihh的分布特征与其在生长板分布不同，提示PTHrP可能对髁突全层软骨细胞均具有增殖促进作用。

Indian Hedgehog表达量在大鼠骨关节炎早期变化的研究

目的 (1)探究大鼠创伤后骨关节炎(osteoarthritis,OA)早期进展中印度豪猪(Indian hedgehog,Ihh)基因表达量的变化;(2)探讨可否通过检测Ihh基因的表达量早期预测OA。方法 SD大鼠80只分8组:1个伪手术组(Sham)和7个实验组(ACLT),依次为1天组、3天组、7天组、2周组、4周组、2个月组、3个月组。RT-PCR检测关节软骨细胞Hh信号通路基因及基质金属蛋白酶13、十型胶原的m RNA表达水平;免疫组化检测关节软骨内Ihh蛋白的表达;ESLIA检测血清中Ihh蛋白浓度;印度墨水染色、番红O染色观察关节软骨退变情况和糖胺多糖含量。结果 Ihh的m RNA相对表达量先升后降,7天组(6.58±2.94)比Sham组(1.03±0.27)、1天组(1.71±1.01)、3个月组(2.40±1.81),明显升高(P<0.05);免疫组化示Ihh蛋白在3天组、7天组呈褐黄色颗粒,且数目超过细胞总数的50%。血清中Ihh浓度同样先升后降,3天组(0.53±0.24)ng/ml比3个月组(0.17±0.06)ng/ml明显升高(P<0.05),7天组(0.57±0.32)ng/ml比Sham组(0.21±0.08)ng/ml、3个月组(0.17±0.06)ng/ml明显升高(P<0.05);3个月组基质金属蛋白酶13和十型胶原的m RNA相对表达量[(19.1±9.52)、(8.13±5.12)]较其它组明显升高(P<0.05);印度墨水、番红O染色和X线可见1个月内关节完整光滑,3个月组关节严重破损,纤维增生。结论 (1)大鼠OA进展过程中Ihh基因的表达量在早期有明显的升高阶段;(2)血清中Ihh蛋白含量有望成为早期发现OA的便利手段。

关节液组分分析在膝骨关节炎康复中的应用研究

目的:研究膝骨关节炎患者康复程度与关节液成分变化之间的关系,寻找特异性及敏感性高的生化标志物,为准确诊断早期膝骨关节炎提供新的方法,探寻康复程度与关节液微环境变化的关系。方法:选择膝骨关节炎患者120例,对所有患者进行膝关节镜检查,按照Outerbridge分级标准将患者分为4组,Ⅰ度到Ⅳ度,每组30例。再将每组分成3组,分别进行自体富血小板血浆(PRP)+ 干细胞,自体PRP,以及臭氧灌注 + 透明质酸钠(HA)治疗。治疗前和治疗后8个月收集膝骨关节炎患者关节液标本各120份。标本均采用ELISA双抗夹心法对关节液中的印度刺猬蛋白、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)及基质金属蛋白酶-13(MMP-13)含量进行测定。比较治疗前后印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13在关节液中的表达差异,以Spearman等级相关分析Outerbridge分级与关节液组分的关系。采用Shahariarre评分标准评价疗效。结果:印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表达水平与Outerbridge分级之间均呈正相关(r=0.790、r=0.476、r=0.684,P < 0.01);预后良好组与预后不良组印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13表达水平比较,差异有统计学意义(P < 0.01);根据Outerbridge分级标准,Ⅰ度患者自体PRP + 干细胞治疗优良率与自体PRP组比较,差异无统计学意义(P > 0.05);Ⅱ~Ⅳ度患者自体PRP +干细胞组治疗优良率明显高于自体PRP组,差异有统计学意义(P < 0.05);Ⅰ~Ⅳ度患者自体PRP + 干细胞组治疗优良率均高于臭氧灌注 + HA组,差异有统计学意义(P < 0.05);Ⅱ度患者自体PRP组治疗优良率与臭氧灌注 + HA组比较,差异无统计学意义(P > 0.05),在Ⅰ度以及Ⅲ~Ⅳ度的患者中2组之间比较,差异有统计学意义(P < 0.05)。结论:自体PRP联合间充质干细胞治疗膝骨关节炎较常规HA + 臭氧灌注治疗效果显著,且膝骨关节炎患者的康复程度与关节液中印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的表达水平相关,说明膝骨关节炎患者的软骨损伤作用机制与印度刺猬蛋白、uPA、MMP-13的表达水平相关。

基于Hedgehog信号通路探讨血清NGF、BGLAP及PGS在颅脑损伤后加速骨折愈合的作用机制

目的探讨Hedgehog信号通路、血清神经生长因子(NGF)、前列腺素(PGS)、骨钙素(BGLAP)在颅脑损伤后加速骨折愈合中的作用和相互关系。方法选取2017年1月至2020年1月在河北省邢台市第三医院就诊的138例因车祸导致的新鲜闭合性股骨干骨折患者,根据是否伴有颅脑损伤分为研究组(n=60)和对照组(n=78)。比较两组术后4、8、12周的骨痂面积和骨折愈合时间,采用ELISA检测术后1 d、术后1、4、8、12周血清NGF、BGALP、PGS、印度豪猪蛋白(Ihh)和锌指转录因子1(Gli1)水平。采用Pearson相关性分析探究上述各因素之间的相关性。结果研究组愈合时间明显短于对照组[(11.69±1.47)周vs.(14.02±1.83)周,P<0.05]。两组术后4、8、12周骨痂面积比较,研究组明显大于对照组(P<0.05)。术后1 d至术后12周,研究组血清Ihh、Gli1表达水平均明显高于对照组(P<0.05),血清NGF、PGS、BGLAP表达水平亦明显高于对照组(P<0.05)。Pearson相关性分析表明,血清NGF、BGLAP、PGS水平与骨痂面积呈正相关(P<0.05),血清Ihh、Gli1水平与血清NGF、BGLAP、PGS水平及骨痂面积也呈正相关(P<0.05)。结论颅脑损伤后Hedgehog信号通路相关蛋白上调,可能与NGF、PGS、BGLAP表达升高存在密切联系,该通路可能参与颅脑损伤后骨折加速愈合。

印度刺猬蛋白调节成骨细胞中p38丝裂素活化蛋白激酶表达的研究

目的观察印度刺猬蛋白（Ihh）对成骨细胞p38丝裂素活化蛋白激酶（p38MAPK）的调节作用。方法取子鼠颅盖骨分离培养成骨细胞，采用实时定量聚合酶链反应（Real-timePCR）检测成骨细胞中p38MAPK的表达量，检测成骨细胞在不同浓度（0、10、50、200μg/L）及不同时问（0、1、2、3d）的Ihh作用下p38MAPK的表达，采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖。结果成骨细胞表达p38MAPK；Ihh促进成骨细胞增殖，促进p38MAPK的表达（P〈0．05）；阻断p38MAPK信号转导通路后，成骨细胞增殖明显受抑制，但不能明显抑制Ihh刺激下的成骨细胞增殖（P〈0．05）。结论p38MAPK在成骨细胞增殖分化中起作用，Ihh通过p38MAPK通路促进成骨细胞增殖。

氟中毒大鼠生长板Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达的变化

目的观察氟中毒大鼠生长板Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达的影响,探讨Ihh信号通路在氟致软骨损伤中的可能作用。方法 32只Wistar大鼠按体重随机分成4组,对照组饮用自来水,染氟组分别饮用含氟50、100和150 mg/L的自来水,3个月后测定大鼠血清及骨组织氟含量,Real-time PT-PCR法检测Ihh、PTHrP mRNA表达情况,免疫组化法检测软骨组织中PTHrP蛋白表达情况。结果染氟组大鼠生长板中Ihh、PTHrP mRNA表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组大鼠生长板软骨细胞不表达或极弱表达PThrP,而氟中毒大鼠生长板静止层和肥大层软骨细胞细胞质中PTHrP蛋白为阳性表达,且随染氟剂量增加而升高。结论过量氟可能通过影响Ihh、PTHrP mRNA及蛋白表达水平,造成生长板软骨增殖、分化失衡。

软骨寡聚基质蛋白与Ⅱ型胶原螺旋肽及印度刺猬蛋白诊断膝关节骨性关节炎的价值

目的探讨关节滑液软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)、Ⅱ型胶原螺旋肽(human typeⅡcollagen helical peptide,HELIX-Ⅱ)、印度刺猬蛋白(Indian hedgehog,IHH)在膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)诊断中的应用价值。方法 KOA患者120例为KOA组,同期体检健康者80例为对照组。采用ELISA法检测2组关节滑液中COMP、HELIX-Ⅱ及IHH表达水平,ROC曲线评估关节滑液COMP、HELIX-Ⅱ及IHH诊断KOA的效能。结果 KOA组关节滑液COMP[(65.34±28.75)μg/L]、HELIX-Ⅱ[(2.75±0.13)nmol/L]及IHH[(17.23±4.32)ng/L]水平均高于对照组[(36.10±9.12)μg/L、(0.81±0.67)nmol/L、(10.75±1.79)ng/L](P<0.05);KOA组X线片K-L分级Ⅲ~Ⅳ级患者关节滑液COMP、HELIX-Ⅱ及IHH水平[(71.10±8.11)μg/L、(2.24±0.56)nmol/L、(21.51±3.03)ng/L]高于Ⅰ~Ⅱ级患者[(62.30±9.71)μg/L、(1.44±0.42)nmol/L、(16.33±4.39)ng/L]和0级患者[(57.60±6.73)μg/L、(0.49±0.40)nmol/L、(13.97±2.09)ng/L](P<0.05),且Ⅰ~Ⅱ级患者高于0级患者(P<0.05);ROC曲线结果显示,关节滑液COMP、HELIX-Ⅱ和IHH诊断KOA的最佳截断值为49.25μg/L、1.47nmol/L、13.80ng/L,AUC为0.918(95%CI:0.871~0.965,P<0.001)、0.858(95%CI:0.793~0.924,P<0.001)、0.780(95%CI:0.696~0.864,P<0.001),准确率为89.0%、84.0%、75.0%,灵敏度为83.3%、76.8%、78.3%,特异度为81.6%、80.0%、64.4%。结论 KOA患者关节滑液中COMP、HELIX-Ⅱ和IHH水平增高,且与KOA病变程度相关,在KOA诊断中具有较高的应用价值。